大黄虫丸预防DMN诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究

1、大黄虫丸预防DMN诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究【摘要】观察大黄虫丸预防大鼠肝纤维化的作用。方法二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，同时用大黄虫丸进展预防，观察其对大鼠血清ALT、AST，肝组织的纤维化程度、血管紧张素1型受体AT1R及其RNA的表达、以及血管紧张素转化酶RNA表达的影响。结果大黄虫丸可降低大鼠血清ALT、AST程度，减轻肝纤维化程度，降低大鼠肝组织AT1R及其RNA表达。结论大黄虫丸能部分抑制大鼠肝纤维化时肝组织AT1R及其RNA的过度表达。【关键词】大黄虫丸；肝纤维化；血管紧张素1型受体；二甲基亚硝胺；大鼠Fundprjet：ItesupprtedbyZhejiangPr

2、vinialEduatinalBureauN：20221096大黄虫丸系?金匮要略?治疗干血劳的名方，抗肝纤维化疗效确切1，但其抗肝纤维化作用机制是否与肝部分RAS相关未见报道。本研究采用二甲基亚硝胺DN诱导大鼠肝纤维化模型，运用大黄虫丸进展预防，以观察其对肝组织AT1R的影响，同时观察其对肝组织AT1R与AERNA表达的影响，从肝部分RAS角度初步讨论大黄虫丸抗肝纤维化的作用机制。1实验材料1.1实验动物清洁级SD大鼠60只，雄性，体重16020g，浙江中医药大学实验动物中心提供。1.2药品与试剂大黄虫丸购自湖南回春堂药业；复方鳖甲软肝片购自内蒙古福瑞中蒙药科技股份；二甲基亚硝胺购自天津市化

3、学试剂公司。谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST试剂盒均购自上海科欣生物技术研究所；Trizl试剂购自美国Invitrgen公司；AT1R免疫组化试剂盒和DAB显色剂试剂盒购自河北博海生物工程开发；RT-PR试剂盒购自上海科延生物技术。1.3实验仪器组织切片机德国Lea公司，恒温水浴箱江苏太仓医用仪器厂，PR循环仪德国Bietra公司，多功能真彩色细胞图象分析管理系统美国ediaybernetis公司，GIS凝胶图像分析处理系统上海天能科技，电泳仪北京市六一仪器厂。2方法2.1造模及分组将大鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，大黄虫丸低剂量组，大黄虫丸中剂量组，大黄虫丸高剂量组

4、分别简称低、中、高剂量组，复方鳖甲软肝片阳性对照组简称阳性对照组。除正常对照组大鼠外，其余50只大鼠按10g/kg体重腹腔注射1%浓度的DN生理盐水溶液进展造模，每周连续3d，共4周12次。2.2实验用药将大黄虫丸与复方鳖甲软肝片分别用蒸馏水溶解制成混悬液，按人与大鼠体外表积比折算的等效剂量给药。造模同时即开场给药预防。大黄虫丸低、中、高剂量组分别按0.54g/kg、1.08g/kg、2.16g/kg体重灌胃给药，复方鳖软肝片按1g/kg体重灌胃给药。模型组与正常组按蒸馏水10l/kg体重灌胃，各组均每天灌胃1次，连续给药4周至造模完毕。2.3大鼠处理方法末次给药当晚禁食不禁水，次日上午空腹按

5、40g/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉，腹腔静脉采血，离心机别离取血清，-20冰箱保存备用。迅速别离肝脏，取大鼠肝左叶肝组织入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，逐级酒精脱水，经透明、常规石蜡包埋，用作肝组织HE染色、苦味酸-天狼红胶原染色及免疫组织化学染色指标的检测。其余新颖肝脏经生理盐水清洗后立即投入液氮中冻存，3小时后移入-80低温冰箱中保存，用于提取总RNA。2.4引物设计与合成从GeneBank数据库中获得大鼠基因AT1R、AERNA全序列，以及内参肌动蛋白-atinRNA序列，利用prier5.0引物设计软件设计出上、下游特异性引物。大鼠AT1R引物序列：上游引物为5-AGTTTTT

6、AG-3，下游引物为5-TGATAAGGGAAAA-3；AE引物序列：上游引物为5-GTGGAGGAGTATGA-3，下游引物为5-AGAGTAGGTTGAG-3；-atin引物序列：上游引物为5-ATGATTGGTTG-3，下游引物为5-GGATATGTATTGT-3。引物由上海博尚生物科技合成。转贴于论文联盟.ll.2.5观察指标及检测方法2.6统计方法实验数据以均数标准差xs表示，采用SPSS13.0统计软件包进展数据的分析处理，计量资料多组间比拟采用单因素方差分析，多组间两两比拟方差齐性时采用最小有意义差异法LSD检验，方差不齐时采用DunnettsT3检验。等级资料采用非参数秩和检验

7、，检验其差异显著性，均以P0.05为差异显著的标准。3结果3.1大鼠一般情况观察模型组大鼠精神差，活动少，皮毛松弛，被毛易脱落，毛色枯黄无光泽，饲料过度消耗。大黄虫丸低、中、高剂量组、阳性对照组大鼠较模型组皮毛有光泽。各组大鼠死亡情况为：低剂量组死亡1只，高剂量组死亡2只，阳性对照组死亡1只，模型组死亡1只。除高剂量组灌胃死亡1只，其余大鼠死亡原因为DN中毒。3.2大黄虫丸对大鼠血清ALT和AST的影响结果见表1。表1对大鼠血清ALT、AST的影响略与模型组比拟，*P0.05，*P0.01；与正常对照组比拟，P0.05，P0.01，与阳性对照组比拟，#P0.05模型组大鼠血清ALT、AST程度

8、较正常组显著升高P0.05，低剂量组血清ALT程度明显降低P0.05，中、高剂量组及阳性对照组的血清ALT、AST的下降明显，差异有非常显著性意义P0.01；与阳性对照组比拟，低、中、高剂量组的血清ALT程度无显著差异P0.05，但在血清AST方面，低、中剂量显著高于阳性对照组P0.05，高剂量组与阳性对照组无显著性差异P0.05。3.3大黄虫丸对大鼠肝组织肝纤维化SSS计分的影响结果见表2。表2对大鼠肝组织肝纤维化SSS计分的影响略与模型组比拟*P0.05；与正常对照组比拟，P0.05，P0.01，与阳性对照组比拟，#P0.05正常组大鼠肝小叶构造完好，无变性、坏死，肝细胞索排列整齐。肝组织

9、根本无胶原分布，仅在中央静脉和汇管区周围以及肝窦内有少量分布。模型组大鼠肝小叶构造破坏，肝细胞索排列紊乱，可见肝细胞不同程度的性坏死，炎性细胞浸润严重。胶原纤维明显增生，互相连接的纤维隔将肝小叶重新分割形成假小叶。大黄虫丸低、中、高组与阳性对照组肝细胞坏死、炎性细胞浸润程度轻于模型组。模型组大鼠肝组织肝纤维化SSS计清楚显高于正常组P0.01，中、高剂量组与阳性对照组大鼠肝纤维化SSS计清楚显低于模型组大鼠P0.05；与阳性对照组比拟，低剂量组大鼠肝纤维化SSS计清楚显升高P0.05。3.4大黄虫丸对大鼠肝组织AT1R表达面积的影响结果见表3。免疫组化结果显示AT1R在正常对照组大鼠肝组织中仅

10、在肝血管壁周围细胞有细微表达图1，模型组大鼠刚组织AT1R呈高表达，在血管壁周围与纤维间隔区域尤其明显图2，低、中、高剂量组以及阳性对照组的大鼠AT1R的表达程度显著低于模型组但高于正常对照组P0.05。见图35。3.5大黄虫丸对大鼠肝组织AT1R与AERNA表达程度的影响结果见表4。表4对大鼠肝组织AT1R与AERNA表达程度的影响略与模型组比拟，*P0.05，*P0.01；与正常对照组比拟，P0.05，P0.01，与阳性对照组比拟，#P0.05与模型组比拟，低、中剂量组AT1RRNA的表达程度明显降低P0.05，高剂量组与阳性对照组AT1RRNA的表达程度的降低非常显著P0.01；与正常对照组比拟，模型组与低剂量组的AT1R与AERNA的表达程度升高非常明显P0.01，中、高剂量组与阳性对照组的AT1R与AERNA的表达程度升高明显P0.05；与阳性对照组比拟，低剂量组的AT1RRNA的表达程度升高明显P0.05。4讨论本研究结果显示，大黄虫丸可降低DN诱导肝纤维化时大鼠血清ALT、AST程度，减轻大鼠肝纤维化程度。免疫组化和RTPR结果说明，大鼠肝纤维化时肝部分AT1R及其RNA、AERNA的表达程度明显升高，提