HIV1重组毒株gag区快速基因分型方法

1、HIV-1重组毒株gag区快速基因分型方法【关键词】人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反响摘要：目的建立一种简便、快速基因分型方法，对广西人类免疫缺陷病毒HIV-1重组毒株gag基因区进展亚型鉴定。方法从HIV阳性样本中提取核酸，使用HIV-1组通用引物对gag区进展第1轮扩增，第2轮使用分别检测亚型和RF01-AE重组型的二套特异性引物放入同一反响管中进展扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同判断亚型。另外设计了一套引物，专门用于检测B/重组毒株。扩增出的所有样本均进展基因测序和系统树分析以验证结果。结果54份样本中，经基因测序和系统树分析证实RF08-B样本4份741%),RF01-A

2、E样本46份8518%),4份741无法确定亚型。经亚型特异性引物PR法检测出4份100%)B/重组毒株，45份9783%)RF01-AE重组毒株，灵敏度为98%，特异性为100%。2种方法检测结果经差异性检验显示，P005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。与基因分析结果吻合。重复实验显示，B/的平均重复性为100%(20/20),RF01-AE为983%(59/60)。结论该方法具有简便、快速，高度灵敏度和特异性的特点，可直接对广西HIV-1重组毒株RF1-AEgag基因区进展分型。关键词：人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反响Rapididentifiatinfrgagre

3、ginfirulatingrebinantfrfhuaniundefiienyvirustype1Abstrat：bjetiveTdevelpeasipleandrapidsubtype-sreeningassayfrthegagreginftheirulatingrebinantfr(RF)fhuaniundefiienyvirustype1(HIV-1inGuangxi.ethdsPrviralDNAfrHIV-psitivesaplesereextratedandsubjetedtthefirstrundPRithuniversalpriersfrthegagreginthatandet

4、etHIV-1grupislates.InthesendrundPR,tpairsfsubtype-speifipriersthateredesignedtdetetsubtypeandRF01-AErespetivelyereaddedintnetube.ThePRprdutsfdifferentsubtypesuldbedistinguishedinagarse-geleletrphresis.Antherpairfsubtype-speifipriersexlusivelydetetingthetheprevalentrebinantstrainsRF07-BandRF08-Basdes

5、ignedandused.Additinally,allfthesesapleseresequenedandanalyzedphylgenetially.ResultsDNAsequeningandphylgenetianalysisfthegagreginfthe54saplesshedthat4saples(7.41%)ereinfetedithRF08-B,46(85.18%)ithRF01-AEand4(7.41%)reainedunlassifiable.Detetinfthesubtype-speifipriersetsrevealedthat4ereB/(100%),and45e

6、reRF01-AE(97.83%),ithanadequatesensitivity(98%)andahighspeifiity(100%).Nn-speifibandsasinallyappearedbutdidntinterfereithinterpretatinftheresults.Thephylgenetianalysisasnsistentithsubtype-speifipriersetsandthensistentrateas98.15%.Theaveragereprduibilityas100%frB/saplesand98.3%frRF01-AEsaples.nlusinA

7、siple,rapidandlstassayisdevelpedfrsubtype-sreeningfRF1-AEinGuangxi.FrtheB/strainsinGuangxi,itneedstbeverifiedfurtherbyinreasingsaples.Keyrds：huaniundefiienyvirustype1(HIV-1；genetisubtype；plyerasehainreatin(PR)人类免疫缺陷病毒-1HIV-1高度变异，不同亚型毒株其生物学特性及；分子流行病学特征均有所不同1，假设能快速、准确地对HIV进展基因分型不仅有助于理解HIV-1转播规律，而且可为说明

8、HIV基因型与生物表型关系、药物耐药性等研究提供资料。近年来，我国学者2建立了一种多重巢式PR法对我国HIV-1主要流行株进展鉴定亚型。然而，由于HIV-1的基因变异度极高，在传播过程中可产生许多具有相对独立的基因序列型别，使得不同地区各亚型间具有其自身的特异性。广西壮族自治区为国内HIV感染的高发区，大局部感染发生在经济尚不兴旺地区的人群中。因此，建立广西HIV-1主要流行株快速基因分型方法非常必要。目前，广西的优势流行株为RF01-AE和RF08-B重组毒株3,4。为此，本研究针对这2种重组毒株gag基因区建立了一种亚型特异性引物PR法的快速基因分型法。1材料与方法11样本来源从广西HIV

9、-I主要流行区采集54份样本，经ELISA初筛和免疫蛋白印迹B确认为HIV阳性样本。12核酸提取采用QIAapBldesiniKit试剂盒德国QiaGen公司从每位感染者的抗凝全血中提取细胞DNA，并冻存于-80冰柜备用。13HIV-1亚型特异性引物的设计亚型特异性引物的设计是整个方法建立的关键。设计的根本原那么：设计的引物位点必须在各个亚型间高度特异，而在同一种亚型内部高度保守。在Prier50软件的帮助下设计出gag区的亚型特异性引物表1)。14HIV-1gag基因区的扩增用nested-PR对HIV-1gag基因区进展扩增，第1轮使用引物GagF2/Gage2，模板15l，反响条件：94

10、5in,521in,722in30s,1个循环；9430s,5230s,721in30s,30个循环；7210in。第2轮模板5l，使用分别检测亚型和RF01-AE重组型的2套亚型特异性引物ag-1/ag-2,ag-ae1/ag-ae2),争套引物放入同一反响管中，为减少非特异性反响，使用热启动和降落PR(TD-PR技术5，945in，521in,722in30s,1个循环；9430s,5230s,721in,3个循环；9430s,5130s,721in,3个循环；9430s,5030s,721in,3个循环；9430s,4930s,721in,3个循环；9430s,4830s,721in,2

11、5个循环，7210in。假如特异性引物PR扩增出的目的条带判断为亚型，那么用专门用于检测B/重组毒株包括RF07-B和RF08-B的亚型特异性引物gag-1/gag-b为内侧引物再进展PR扩增，以判断是否为重组形式。反响条件：942in,481in,722in,1个循环；9430s,4830s,721in,35个循环；7210in。同时使用引物306/n-gag扩增所有样本并进展基因测序，用于系统树分析及亚型鉴定以验证特异性引物分型结果是否正确。反响条件：942in,5050s,72in,1个循环；9430s,5030s,721in,35个循环；7210in。第1轮和第2轮PR反响体系均为50

12、l,dNT/P浓度为200l/L,Taq酶为25U，引物浓度为04l/L,gl2浓度为15l/L。表1gag区PR扩增使用的引物略内侧特异性引物注：R=A或G15PR产物检测取5l第2轮PR扩增产物在2琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭EB染色检测，紫外摄影拍照，根据arkers分子量大小来断定结果。亚型片段190bp;RF01-AE片段881bp;B/片段1079bp。16序列测定对于全部经引物306/n-gag扩增的样本，经切胶，纯化后，以306为测序引物，提纯的PR产物为模板，采用DNA测序试剂盒美国ABI公司,在PT-220型多通道PR仪美国J公司上进展测序反响。反响产物经提纯后，采用310型

13、全自动毛细管DNA测序仪美国ABI公司进展序列测定和分析。17序列分析美国LsAlas国家实验室HIV核酸序列库中提供基因分型工具BLAST程序进展基因型鉴定；用lustalX进展排序和EGAversin21软件进展分析。亚型分析使用的各个亚型参考序列来自美国LsAlasHIV基因数据库。18检测该方法的重复性在RF01-AE样本中随机选取12份，RF08-B4份，共16份样本使用上述方法重复5次。2结果21样本基因测序和系统树分析54份阳性样本中通过引物306/n-gag扩增最终获得50份样本的基因序列，经BLAST程序鉴定出4份样本gxu0402,gxu0416、gxu0418和gxu04

14、19为RF08-B重组毒株，余下46份为RF01-AE重组毒株。将50份基因序列与国际各亚型标准株的基因序列进展系统树分析显示。4份RF08-B样本与RF08-B98N006和RF08-B97NGX7f靠得很近，而46份RF01-AE中，有44份与RF01-AE97NGX2f聚成一簇，另外2份样本gxu0432和gxu0439与RF01-AE93JPNH1和RF01-AE93TH057非常接近。22亚型特异性引物PR扩增局部样本经亚型特异性引物PR扩增后的电泳结果见图1和图2。根据不同亚型扩增出的目的带位点不同，判断出亚型结果。54份样本中，采用特异性引物共扩增出49份样本，其中亚型4份，RF

15、01-AE重组毒株45份9783%,45/46)。进一步使用B/重组特异性引物扩增亚型特异性引物鉴定出来的4份样本，发现这4分样本均为B/重组毒株100%,4/4)。以基因测序法为金标准，可知亚型特异性引物PR法的灵敏度为98%，特异性为100%。23亚型特异性引物PR法的重复性重复实验采用4份RF08-B样本和12份RF01-AE随机样本进展5次重复。结果显示，RF08-B重组毒株平均重复性为100%20/20，而RF01-AE在5次重复中有1次出现1份样本检测不出，其平均重复性为983%59/60。：DNA分子量；1：H2；2：阴性对照；3：xu0433;4:gxu0440;5:gxu04

16、51;6:gxu0462图1局部RF01-AE样本琼脂糖电泳结果略：DNA分子量；1：H2；2：阴性对照；3:gxu0418;4:gxu0419图2B/样本琼脂糖电泳结果24基因测序法与亚型特异性引物PR法比拟54份己确认的阳性样本，基因测序法检测并正确分型的样本是50份，检出率为9260%，特异性引物PR法为49份，检出率为9074%。2种方法检测结果经差异性检验显示，2=0,P005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。3讨论本研究结果说明，亚型特异性引物PR方法对于亚型的鉴定结果与基因测序、系统树分析得到的结果是吻合的，该方法的特异性达100%。用亚型特异性引物扩增样本时，有时一

17、会出现非特异性扩增条带，干扰实验结果。非特异性条带位置一般不在特异性位置。为防止误判，可以通过跑厚胶并且延长电泳时间，使目的条带与非特异性条带充分分开。通常在紫外灯下，非特异性条带要比目的条带弱。出现非特异性扩增条带通常有如下的原因：(1)引物与模板错配扩增产生，引物与模板亚型相符，不仅能在特异性位点上与模板结合，亦能在远离特异性位点的地方与模板结合，这种情况错配通常靠近引物5端的位置，电泳时会出现两条带；(2)引物之间形成的引物二聚体，一般出如今80bp左右的位置，通过长时间电泳可使此条带消失；(3)某一亚型的特异性引物与另一亚型的模板错配扩增产生，因2套引物放入同一反响管中，所以可能出现此

18、情况，为了防止此情况发生，因此，在设计引物时使引物在3端与别亚型的模板至少有2个碱基产生错配。用本研究所建立起的方法对54份样本的gag基因区进展检测，发现有些样本在1200bp左右的位置会出现一条非特异性扩增，因第1轮PR扩增的条带位置在1242bp,因此疑心此非特异性扩增条带为第1轮PR扩增出的目的带，将第1轮PR产物与用亚型特异性引物扩增出的第2轮产物同时进展电泳，证实了这一推测。为了减少此情况的发生，可减少第1轮反响的模板量，同时在参加反响体系、模板和酶后尽量减少室温放置时间或在冰盒上操作。本实验结果说明，亚型特异性引物PR法，灵敏度为98%，特异性为100%，结果显示，其灵敏度和特异性均较好。重复性实验显示，B/亚型的平均重复性为100%,RF01-AE重组毒株为983%,说明一该方法在实际中是可行的。但由于RF08-B样本例数不多，因此，本研究所建立起的方法对于HIV-1B/重组毒株分型的准确性有待扩大样本量进一步证实。参考文献1杰伊A，利维.艾滋病病毒与艾滋