p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究

1、38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究【摘要】目的：讨论慢性移植物抗宿主病GVHD狼疮样小鼠肾组织p38APK的表达变化,进而分析p38APK在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将12只雌性(57BL/6JDBA/2)F1杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组6只。于16周末处死，取肾行HE和assn染色，应用免疫组化方法检测TGF-1、p38APK、P-p38APK在肾脏的定位表达，RT-PR法研究各组肾组织TGF-1、p38APKRNA的表达,esternblt定量检测TGF-1、p38APK、P-p38APK蛋白的表达程度，并观察两组小鼠24h尿蛋白排泄量。结果：与

2、正常对照组比拟,模型组小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-1、p38APK和P-p38APK蛋白及RNA表达均明显增加(P0.01),TGF-1与p38APK的表达呈正相关(r=0.418,P0.05)。结论：GVHD狼疮样小鼠肾组织中TGF-1、p38APK和P-p38APK蛋白及RNA表达明显上调,p38APK信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。【关键词】慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；p38APK；小鼠狼疮肾炎lupusnephritis,LN是系统性红斑狼疮systeilupuserytheatsusSLE最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征

3、，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，在其开展过程中，多种因素发挥着重要作用,其中TGF-1起着关键作用。有丝分裂原活化蛋白激酶(itgen-ativatedprtEinkinase,APK)级联是细胞内重要的信号转导系统,它参与胞外信号从外表转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来许多研究结果说明，其亚族p38丝裂原活化蛋白激酶(p38APK)作为信号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生开展中起着重要作用，但在LN肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗

4、宿主病(hrnigraftversushstdisease,GVHD)狼疮样小鼠模型,讨论作为TGF-1下游信号介质，p38APK在LN开展过程中的表达与活化及其可能的作用机制。1材料与方法1.1实验动物810周龄雌性(57BL/6JDBA/2)F1杂交鼠(以下称杂交鼠)及67周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心,体重(20.171.20)g,SPF级，饲养于本校公共卫生学院SPF动物房。1.2模型的建立与分组1制作GVHD狼疮样小鼠模型。按随机、对照设计原那么将12只杂交鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞,制成单细胞悬液(约60%脾细胞、30%胸

5、腺及10%淋巴结细胞),分别于0、3、7、10d经尾静脉注射于模型组杂交鼠,用台盼蓝染色和细胞计数板计数,保证活细胞数大于95%,且每次给予细胞数为50106个。正常对照组那么于相应时间经尾静脉注射等体积生理盐水。两组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取1次24h尿,至16周处死动物，立即取下肾脏,一局部置于-70低温保存,另一局部置于10%中性福尔马林溶液中固定后行组织病理学检查。1.324h尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液15稀释后按操作说明书操作。1.4RT-PR1.4.1总RNA提取从-70低温冰箱中取出肾组织,迅速用Trizl(晶美生物技术)匀浆提取总RNA。取5l总RNA进

6、展甲醛变性凝胶电泳,紫外灯下观察5、18、28s条带明晰提示RNA完好无降解。1.4.2逆转录逆转录反响体系如下:在PR管中参加10逆转录缓冲液1l,gl2(25lL-1)2l,ligdT1l,dNTPs(10lL-1)2l,RNaseinhibitr0.25l,AV逆转录酶(TaKaRa公司)1l,总RNA2.75l,3010in后42逆转录50in,99灭活逆转录酶5in,55in,所得DNA保存于-20用于PR扩增。1.4.3PR扩增TGF-1、p38APK及GAPDH内参照引物用DNAlub软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38APK上游引物5-tgagagtttagt

7、at-3,下游引物5-aggaaaatatat-3,产物为463bp；TGF-1上游引物5-tgttagtaagagaa-3,下游引物5-ttggaagtagtaga-3,产物为267bp；GAPDH上游引物5-attgaagggtggagaaa-3,下游引物5-aggaaatgagttgaa-3,产物为608bp。反响体系:5PR缓冲液10l,gl24l,dNTPs1l,上下游引物各1l,DNA模板1l,TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.25l,补足双蒸水至50l。EppendrfAG22331PR扩增仪扩增,p38APK条件为:94预变性3in；94变性30s,54退火40s,72

8、延伸1in,循环36次；72终末延伸10in。TGF-1改退火温度为56，其余与p38APK一样。1.4.4产物检测扩增产物在含0.5lL-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以45V-1电压降电泳30in。于IageasterVDS凝胶扫描仪上成像,用TtallabV2.01凝胶图像分析软件进展半定量分析。所有TGF-1、p38APK扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准校正,以TGF-1/GAPDH、p38APK/GAPDH表示。1.5病理检查2连续切片,置多聚赖氨酸包被的载玻片上,分别作HE和assn染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。1.6免疫组化检测SAB法免疫组化染色(试剂盒购自晶美

9、生物技术)：取2厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液,室温下孵育10in；滴加胃蛋白酶修复抗原,37孵育15in;加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30in；滴加兔抗小鼠P-p38APK单克隆抗体(1100,ellSignalingTehnlgy公司),或兔抗小鼠p38APK多克隆抗体(1100,ellSignalingTehnlgy公司)，或兔抗小鼠TGF-1多克隆抗体(1100,Santaruz公司)，4孵育过夜,37复温30in；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体,37孵育30in；加HRP标记的链亲和素,37孵育30in；DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片。阴性对照：以PBS替代一

10、抗。1.7esternblt取-70保存的肾皮质约100g,参加预冷的蛋白裂解液0.5l充分裂解。43000rin-1离心10in取上清。测定蛋白质含量，取100g蛋白参加上样缓冲液,煮沸3in后进展12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转PVDF膜,TTBS封闭液37封闭2h,分别与兔抗小鼠TGF-1多克隆抗体、兔抗小鼠p38APK多克隆抗体和兔抗小鼠P-p38APK单克隆抗体,4过夜,参加12500稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗,37,2h，DAB显色。每组重复3次。esternblt条带信号强度应用Kdak1D图像分析软件进展定量分析。目的条带的相对含量=V目的条带/V对照组。对

11、照组的相对含量为1.0，1.0为表达阳性。1.8统计学处理计数资料以x-s表示,采用SPSS13.0统计软件进展方差分析、t检验，相关性采用Spearan法分析，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.124h尿蛋白量测定结果模型组小鼠24h尿蛋白总量为7.830.37g，显著高于相应正常对照组小鼠的1.360.16g，P0.01。2.2肾组织p38APKRNA、TGF-1RNA半定量结果RT-PR检测结果见图1。模型组小鼠肾组织p38APK、TGF-1RNA表达分别与相应正常对照组比拟差异有统计学意义(P0.01)，见表1。表1两组小鼠肾组织p38APK、TGF-1RNA表达的半定量分析1)

12、与正常对照组比拟，P0.012.3肾组织HE、assn染色结果正常对照组小鼠肾小球、近端小管及远端小管的大孝形态正常。模型组小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,系膜区增宽，大量基质沉积,可见局部肾小球呈现萎缩硬化改变;肾小管呈多灶性萎缩及空泡变性,上皮细胞胞核脱落、坏死,管腔内可见大量蛋白管型，肾间质基质沉积明显。2.4免疫组化结果2.4.1肾组织中TGF-1表达变化正常对照组小鼠仅在少数肾小管有微弱TGF-1表达,而模型组小鼠肾小球细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质浸润的单核细胞胞浆均有TGF-1明显表达，染色细胞数明显增多，细胞染色程度加深。见图2。2.4.2肾组织中p38

13、APK表达变化正常对照组小鼠肾脏远端肾小管、近端肾小管及集合管上皮细胞均有少量p38APK表达；模型组小鼠肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、肾小管间质中阳性细胞数显著增加，阳性表达颜色加深。见图3。2.4.3肾组织中P-p38APK表达变化正常对照组小鼠仅肾小管间质有极少量的P-p38APK表达；模型组小鼠肾组织P-p38APK主要表达在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、近端和远端肾小管及集合管上皮细胞。见图4。2.5esternblt检测结果esternblt检测结果见图5。模型组小鼠肾组织TGF-1、p38APK、P-p38APK蛋白表达较正常对照组小鼠明显升高，差异有统计学意义(

14、P0.01)，见表2。表2两组小鼠肾组织p38APK、TGF-1和P-p38APK蛋白表达的定量分析2.6肾组织TGF-1、p38APK和P-p38APK相关分析实验小鼠肾组织p38APK表达与TGF-1表达呈正相关(r=0.418,P0.05)，P-p38APK表达与TGF-1表达呈正相关(r=0.432,P0.05)，P-p38APK表达与p38APK表达呈正相关(r=0.414,P0.05)。3讨论肾脏纤维化是几乎所有肾脏疾病开展到终末期肾功能衰竭的共同通路,包括LN在内许多进展性肾脏疾病均具有TGF-1持续过度表达的特征。TGF-1是公认的肾脏致纤维化因子之一,而APK通路是细胞内TG

15、F-1信号通路的重要成分。其亚型p38APK是控制炎症反响最主要的APK家族成员之一,其信号转导途径是近年来细胞生物学研究的热点之一。p38APK信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信号:细胞外刺激激活KKK(APkinasekinasekinase),转而激活KK(APkinasekinase),然后通过双位点磷酸化成为磷酸化p38APK而激活APK信号转导通路,参与应激条件下细胞的凋亡、免疫调节、细胞转分化及炎症反响过程2。eyer-Ter-Vehn等3研究说明，TGF-1通过活化p38APK诱导人成纤维细胞胶原的合成，纤维连接蛋白(FN)、-SA的表达及细胞增殖,p38APK特异性

16、抑制剂能抑制上述表达，说明p38APK在TGF-1诱导的肌成纤维细胞转分化及细胞外基质合成中发挥重要作用。Stabe等4研究单侧输尿管梗阻UU大鼠肾间质纤维化动物模型中p38APK信号通路的作用时显示，磷酸化p38APK在UU大鼠肾间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞均明显增加，而以特定p38APK阻断剂NP31169处理UU大鼠，那么肾间质纤维化程度明显减轻，提示p38APK可能作为TGF-1系统下游信号分子在肾间质纤维化中起作用。Li等5通过构建阿霉素肾病模型发现，p38APK和TGF-beta1/Sad2信号通路在该模型中相继出现，而p38APK通路抑制剂SB203580及TGF-1型受体AL

17、K5抑制剂ALK5协同作用那么可以降低肌成纤维细胞的积聚以及型胶原和FN的表达，进而阻碍肾小球硬化和间质纤维化的进展。Niulesu等6对人近端肾小管上皮细胞HK细胞株的研究那么说明，TGF-1诱导FN的生成是依赖于p38APK通路而非Sad通路。以上研究说明,p38APK确实参与了多种肾脏病肾脏纤维化的发生开展过程,是肾脏固有细胞重要的信号转导分子。但是,p38APK信号转导途径是否与LN肾纤维化有关,目前尚未见报道。LN为免疫复合物性肾炎,各种致病性自身抗体通过不同机制形成免疫复合物沉积于肾脏,诱发肾脏损害。GVHD狼疮小鼠是国际公认并被广泛应用的LN小鼠模型，其临床和病理改变酷似人类型或

18、型(H分型)LN,本实验我们通过构建该模型,从RNA和蛋白质两个不同程度，观察小鼠肾组织p38APK和TGF-1的表达分布及表达量的变化。结果显示,模型组小鼠24h尿蛋白量较正常对照组明显升高,病理组织学检查发现模型组出现肾小球硬化、基质大量增生及间质纤维化，这说明我们成功构建了GVHDLN小鼠模型。而且实验结果说明,正常对照组小鼠的肾组织p38APK有一定的根底表达,但其活化形式P-p38APK仅有极少量表达，模型组p38APKRNA和蛋白表达明显增多，同时P-p38APK表达亦相应增加，与正常对照组相比具有显著差异。另外，模型组TGF-1表达明显增加，且p38APK的表达强弱与肾组织TGF

19、-1的表达程度呈明显正相关。这些结果提示,p38APK在GVHD狼疮样小鼠模型发病中可能起重要作用,可能介导了肾组织TGF-1的表达,从而促进肾小球硬化及间质纤维化。对于上述结果的可能解释是：1活化的TGF-受体通过激活TGF-活化蛋白激酶1(TAK1)和TAK1结合蛋白1(TAB1)(相当于APKKK),启动p38APK信号通路，发挥致肾脏纤维化的生物学效应7；2TGF-1除激活p38APK通路外，还能激活Sad通路，p38APK与Sad两条通路之间存在串话rsstalk现象8，p38APK通路也可能通过与Sad通路的串话调节Sad介导的TGF-1的生物学效应；3p38APK的激活能增强核转

20、录因子AP-1、NF-B等的DNA结合才能,这些转录因子激活后可通过增加FN基因的转录活性,直接诱导FN的产生，同时进步TGF-1RNA的表达和型胶原的产生，高表达的TGF-1维持p38APK后期的持续活化，引起FN的持续累积，即p38APK在TGF-1诱导FN聚积过程中起着重要的调节作用；4p38APK还可通过介导细胞转分化等作用，参与肾纤维化和肾功能进展性损伤的过程。综上所述，p38APK可能作为TGF-1系统下游信号介质，在LN的发病以及病变的进展过程中发挥重要作用。因此，抑制p38APK的活化及分泌有望成为阻止和延缓LN肾纤维化的一条较好途径。【参考文献】1任文英,陈香美,邱全瑛,等.

21、慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型的诱导J.中国比拟医学杂志,2022,14(4):215-222.2YAL,AKIRAN,YUIHIA,etal.Rlefitgen-ativatedprtEinkinaseinrenalinjuryinduedbyhrnialdsterneinfusinJ.hinaJderned,2022,21(14):15-21.3EYER-TER-VEHNT,GEBHARDTS,SEBALD,etal.p38inhibitrspreventTGF-beta-induedyfibrblasttransdifferentiatininhuantennfibrblastsJ.InvestphthallVisSi,2022,47(4):1500-1509.4STABE,ATKINSR,TESHGH,etal.Therlefp38alphaitgen-ativatedprteinkinaseativatininrenalfibrsisJ.JASNephrl,