三氧化二砷与刺五加合用诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

1、三氧化二砷与刺五加合用诱导HeLa细胞凋亡的实验研究【关键词】三氧化二砷；,刺五加；,HeLa细胞；,凋亡摘要：目的讨论三氧化二砷与刺五加合用对癌细胞生长的抑制作用及其机理。方法以HeLa细胞的生长抑制情况，流式细胞仪PI单染法检测药物诱导细胞的凋亡状况。结果两药合用24h组细胞变小变圆，脱落情况都较其他组明显，该组细胞生长抑制率明显高于单用组，合用24h组细胞的凋亡率明显高于合用16h和8h组P0.01。结论刺五加可以作为三氧化二砷的抗癌增效剂，两药合用有很强的抗癌活性，其作用机理与抑制癌细胞生长、诱导其凋亡有关。关键词：三氧化二砷；刺五加；HeLa细胞；凋亡ExperientalStudy

2、ntheApptsisfHeLaellsInduedbyArseniTrixideandaanthpanaxsentisusAbstrat:bjetiveTinvestigatetheanti-tureffetfArsenitrixideandAanthpanaxSentisusnarinaellsanditsprbableehanis.ethdsHeLaellsereulturedasapathlgialdel.HeLaellsstruturalhangeereexainedbyinvertedphaseirspe.Theinhibitineffetnthegrthfellsasevalua

3、tedbyirulturetetrazliuassay(TT).Theapptsisfellseredetetedbyflytetry(F).ResultsTheellsfthegrupftediinesusedtgetherturnedsallerandrunderthanthergrups.Thegrthinhibitedratefthisgrupashigherthanthatfntrlgrup.Theapptsisrateftediinesusedtgether24hursashigherthan16hursand8hurs(P0.01).nlusinAanthpanaxSentisu

4、saniprvetheantitureffetsfArsenitrixide,buthetheritandereasethetxiitiesfArsenitrixiderntisrthrestudying.Keyrds:Aanthpanaxsentisus;Arsenitrixide;HeLaell;Apptsis三氧化二砷As23是中药砒霜的主要成分，祖国医学中它曾被用于治疗恶性肿瘤等多种疾病，但As23又是一种能引起机体细胞染色体畸变的剧毒物质，故长期以来它的药用价值一直被其毒副作用所掩盖，直到近年来，我国研究者发现As23对急性早幼粒细胞白血病具有良好的治疗效果1，2，它的药用价值才被人

5、们重新审视，有关As23抗肿瘤作用及其机理的研究近年来获得了较大进展，发现该药具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用35。刺五加Aanthpanaxsentisus是临床上常用中药，具有益气健脾、补肾安神的成效，可作为细胞毒抗癌药的辅助剂。动物实验证实，刺五加能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制实验性肿瘤的生长和转移6。本研究以人宫颈癌细胞系HeLa细胞为病理模型，将刺五加与As23结合作用于HeLa细胞，以讨论两药合用对肿瘤细胞生长抑制和诱导其发生凋亡的作用，理解刺五加对As23的抗肿瘤作用是否具有增强效应，为临床上两种中药合用治疗恶性肿瘤提供细胞学的实验根据。1材料与方法1.1药品与仪器刺

6、五加注射液20l/支，黑龙江省珍宝岛制药；亚砷酸注射液规格10g/10l,哈尔滨伊达药业；四甲基偶氮唑盐TT,Ares公司；RPI1640培养基美国GIB公司；新生牛血清杭州四季青生物制品公司；酶标仪560型，美国BIRAD公司，流式细胞仪FASalibur型，美国BD公司；数码相机日本ann公司。1.2细胞系HeLa细胞，为人宫颈癌细胞系，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心T。1.3药用浓度确实定1.3.1刺五加药用浓度确实定采用TT法，取对数生长期HeLa细胞，1105/l的细胞100l至96孔培养板，参加等量不同浓度的刺加五溶液，使各组终浓度分别为0.1，0.5，1，1.5g/l，每个浓

7、度组和对照组均设5个重复孔，以加细胞而不加药物组为空白对照组。37，5%2培养箱培养24h后，取出培养板，弃旧培养液，每孔参加5g/l的TT溶液20l，37继续培养4h，弃培养液，每孔参加DS150l，振荡15in，使结晶物充分溶解，最后在酶标仪上用490n波长测定各孔的D值，计算细胞存活率和半数抑制浓度I50，从而确定刺五加的用药浓度为0.5g/l。1.3.2As23药用浓度确实定参考文献，采用最小有效浓度2l/L7。1.4两药合用对HeLa细胞的生长抑制实验采用TT法，实验共分4组，空白对照组，As23组，刺五加组及As23与刺五加合用组，所有操作方法同3.1，最后计算细胞的生长抑制率。生

8、长抑制率=1-实验孔平均D值对照孔平均D值100%1.5细胞凋亡的检测采用流式细胞仪PI单染色法取24孔培养板3个，每板随机分为4组空白对照组，As23组，刺五加组及As23与刺五加合用组，每组6个重复孔，每孔参加浓度为1105/l的HeLa细胞悬液800l，生长至对数生长期，去旧液，每孔加含10%新生牛血清的1640培养液，同时分别参加生理盐水、刺加五溶液，As23及两药合加，使每孔液体总量相等，同时保证每孔刺五加终浓度为0.5g/l，As23终浓度为2l/L37，5%2培养箱分别培养8，16，24h后，搜集每组细胞，PBS洗涤1次，离心去PBS，参加冰预冷的70%乙醇3l，4固定24h以上

9、，离心去固定液，3lPBS重悬细胞。离心5in去PBS，每管参加1lPI染液，室温避光反响30in。制备好的细胞悬液经300目尼龙筛网过滤后立即在流式细胞仪上检测，ELLQuest软件获取并分析检测数据。1.6细胞形态学观察按上述方法分别让药物作用细胞8，16，24h，然后在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并用数码相机照相记录结果。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1细胞生长抑制率刺五加与As23合用对HeLa细胞增殖有显著的抑制作用。结果见表1。表1药物对HeLa细胞的生长抑制率(略)与b比拟，P0.01，与a比拟，P0.012.2HeLa细胞的凋亡分别观察药物作用HeLa细胞8，16，24h的

10、凋亡情况，结果显示两药合用能明显诱导HeLa细胞凋亡，且有明显的时间依赖性见表2，合用16，24h流式检测出现明显的凋亡峰。见图1。a对照组流式b两药合用24h凋亡两药合用16h凋亡图1刺五加与As23合用诱导HeLaxl细胞凋亡的流式检测图(略)表2药物作用HeLa细胞不同时间的细胞凋亡率(略)与相对应时间a，b各组认及生理盐水组比拟，P0.01；24与8，16比拟P0.01；b与相对时间a组和生盐盐组比拟，P0.053讨论细胞凋亡apptsis是机体中普遍存在的重要的生物学事件，是受基因调控的主动性死亡过程，其形态变化和生化特征明显不同于细胞坏死，这种特殊的细胞死亡方式对机体发育和正常功能

11、的维持有重要意义，而肿瘤的发生开展不仅与肿瘤细胞增殖异常有关，也与肿瘤细胞凋亡异常有亲密关系。大量的研究说明，抗肿瘤药物的一个重要作用机理是诱导肿瘤细胞发生凋亡2。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗癌药物设计和挑选的新靶点，与诱导细胞坏死相比，通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞不会引起机体强烈的炎症反响。由于正常细胞与肿瘤细胞在表达某些凋亡相关基因方面存在差异，诱导肿瘤细胞凋亡的治疗形式可减少抗癌物损伤正常组织所引起的副作用。自1996-08Siene杂志介绍中国科学家应用As23成功治愈急性早幼粒细胞白血病autepryelytileukeia,APL的成果以来8，对As23抗肿瘤作用的探究引起了世界医

12、学界的重视。除白血病以外，As23对实体瘤也有抑制作用，它能诱导多种癌细胞发生凋亡，其抗癌谱较为广泛，是一种具有良好应用前景的抗癌药，该药诱导细胞凋亡的主要标志为细胞形态学和生化学等方面的特异性改变7，9。刺五加注射液系刺五加全株经提炼而来，含黄酮、刺五加多糖、丁香甙等多种有效成分。该药所具有扶正固本、益气健脾、补肾之成效是通过增强机体的免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤效应的10。有研究说明，刺五加多糖对实验性动物移植瘤，药物诱发瘤，小鼠自发白血病等都有一定的抑制作用，还能减轻某些抗癌药物的毒性，其作用机理可能与引起细胞膜磷脂的变化有关11，12。HeLa细胞为人宫颈鳞癌上皮细胞系，在体

13、外培养条件下，易于生长繁殖，常被应用于细胞生物学研究和抗癌药物的挑选，故本实验选用该细胞系作为病理模型。本研究结果显示，刺五加与As23合用对HeLa细胞具有明显的生长抑制和诱导凋亡作用，合用组细胞的生长抑制率和凋亡率分别与两药的单用组比均具有显著性差异P0.01。说明刺五加与As23合用具有很强的抗肿瘤活性两者可产生协同作用，刺五加可以作为As23抗肿瘤作用的增效剂。至于两药合用抗肿瘤作用的分子机理还有待进一步研究。参考文献：1张鹏.王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒白血病J.中华血液学杂志，1996，172：58.2ShenZX,henGQ,NiJH,etal.Use

14、farsenitrixideinthetreatentfautepryelyti:linialeffiayandpharakinetisinrelapsedpatientsJ.Bld,1997,89(9):3354.3KarenH.A.Intrdutin:ThehistryfArsenitrixideinanertherapyJ.Thenlgist,2001,6(2):1.4haadA.H.D.TrialsfArseniTrixideinultipeylaJ.anerntrl,2022,10(5):370.5黄浏姣，赵刚.三氧化二砷抗肿瘤作用及其机理的研究现状和展望J.湖北中医学院学报，202

15、2，71：60.6冯雪梅，叶红军，韩登春，等.刺五加叶皂甙对动物实验性肝癌抑制作用的研究J.中国老年医学杂志，1999，195：298.7吕秀宁，郑杰.As23诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡与细胞内端粒酶活性关系的研究J.东南大学学报医学版2022，224：227.8GurrJR,LinY,HKy,etal.IndutinfhratidbreaksandtetrapldyinhinesehastervaryellsbytreatentithsdiuarseniteduringG2phaseJ.utatRes,1993,319(2):135.9YuDing,angZhihui,ZhuLiyuan,etal.NulearatrixassiatedprtEinPL:anarsenitrixideapptsistherapeutitargetprtEIninHepG2ellsJ.hineseedi