限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项

1、实验四 限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。其中类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。 限制性内切酶识别序列长度一般为48个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。5GAATTC33CTT AAG 5 这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由Eco

2、R I产生的其它分子末端相连接。限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 l, 含0.21 g DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50100 l，DNA用量在1030ug。本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。 在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切

3、反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、 电泳设备等。2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。三、操作步骤1限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。2. 酶切反应体系（10ul）：酶解缓冲液（10buffer） 1 ul限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U) 底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）灭菌ddH2O 加至10 ul限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后60

4、00 r/min，离心15s。37水浴消化2h。3.酶切完毕，取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切反应效果，必须用DNA分子量标准物同时进行电泳以确定DNA片段的大小。如果酶切不完全，可继续.酶解消化反应，或加入适量酶后继续反应。5. 经电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置65水浴中1015min，中止酶切反应，将剩余酶切产物保存于?C20备用。 四、注意事项 1.限制性内切酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。 2. 限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分摇匀。 3. 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰

5、到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。 4. 酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深。 5. 酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。 6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积的10%，以避免酶液中甘油干扰反应 。酶量过大（25U/ug DNA）时，有产生所谓星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少NACL和存在M等情况下，都有可能出现星号活性。五、相关问题1.酶的保存不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液

6、中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：Tris-HCl （7.47.8）： 维持稳定的pH范围。50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的离子强度。0.1mmol/L EDTA： 络合掉能激活限制酶的镁离子。1mmol/L DTT： 保护酶分子上的还原性基团。200-500ug/ml BSA： 牛血清白蛋白提高溶液中蛋白质的浓度，防止蛋白质分子浓度过低而导致酶分子变性。50%的甘油： 使酶液保存于-20不至冻结。1-5 g/L的Triton-100： 这是一种非离子型表面活性剂，能防止蛋白质分子的表面变性作用。2. 酶单位的定义限制酶的单位

7、通常定义为：1U的酶能在约50ul合适的反应缓冲体系中，在1h内完成酶切1ug的DNA。确定限制酶单位的具体操作方法是分别向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），当电泳观察到酶切片段的条带不再发生变化时说明已作用完全，完全切割的最少酶量定为1U的酶量。3. 限制酶的作用条件限制酶切割DNA的反应中，酶切条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系，除了这些条件外，DNA的纯度与浓度也会影响酶切效果，只有在正确选择酶反应条件时才能达到最佳酶切效果。（1）作用温度早期的酶切反应都在37进行，这种方法虽然简单、统一，但却不能达到每个酶的最适反应温度。为了达到最佳酶切的效果，

8、最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度。（2）缓冲体系限制酶反应的缓冲体系大致相同，都含有以下组分：约100mmol/L的Tris-HCl，作用是将酶反应体系的pH维持在7.5-8.5；约10mmol/L的MgCl2，作用是为限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保护还原性基团；约150mmol/L的NaCl，作用是提供合适的离子强度。由于认识的局限性，早期的限制酶反应体系仅根据其中NaCl含量的不同分为高盐、中盐与低盐三种，这同样不能使每种酶获得最适反应条件。现在提供酶的很多厂商能提供4-10种缓冲体系，其中各必需成分之间只有很小的差别，目的是使每种酶都发挥最大的作用。缓冲液一般

9、配成10倍的浓度，使用时以1/10的比例加入，当然为了减小吸量误差也可自行配制5倍的缓冲液。 (3) 反应体积与时间酶反应体积一般不宜小于20ul。因为过小的反应体积在加入各种成分时易产生误差，甘油含量易超过10%。在37保温可因水分蒸发而明显改变反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活力。同时还要考虑反应完毕进行电泳时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显出清晰的泳带。常规的酶切反应一般控制在60min内进行，但也可以根据切割对象与所用的酶将保温时间延长至十几个小时。(4) DNA的纯度与浓度除了上述酶反应条件外，影响酶切效果的最主要因素是DNA的纯度。例如，样品中含有大量RNA杂质时会因减少了酶

10、的有效浓度而影响酶切效果；某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。至于抽提过程中未除净的各种影响因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等。DNA纯度的另一个指标是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后电泳结果显示出不清晰条带或成为一片红色（术语称Smear）时，可肯定系统中已经污染了DNA酶。DNA样品中含有大量RNA时可用RNA酶处理；含有结合在DNA上的杂蛋白与DNA酶时都可用氯仿/异戊醇抽提；当样品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物质时可以通过沉淀更换一个新的缓冲体系。当然，酶切失败时也不能排除除DNA外的一切因素，

11、如无菌水，EP管，吸咀等的干净程度以及内切酶自身的酶活性情况。除纯度外，DNA的浓度也会影响酶切效果，一般DNA质量浓度在1ug/20ul才能得到较好的酶切效果，质量浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。 (5)终止酶切反应的方法如果需对酶切片段进行连接或标记等操作时，首先要将限制酶灭活。灭活的方法可分为三种：第一种是向反应缓冲体系中加入终浓度为10-12.5mmol/L的EDTA，原理是络合掉酶反应中所需的镁离子。但这种方法会影响需镁离子的后续反应。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法来更换缓冲体系，以除去EDTA，但这样就会造成DNA的损失。第二种方法是热失活：一般的酶如EcoR等在65保温60min即可；另一些酶如Hind 等需在85保温30min方能达到目的；极端的