基因工程原理与技术全套课件完整版电子教案最新板

1、基 因 工 程“十二五”普通高等教育国家级规划教材基因工程概论 十八世纪以前，圣经宣扬的神创论或创世说在整个西方文化中占据着统治地位。 神创论认为，地球及万物是上帝在大约6000年以前，即公元前4004年10月26日上午9：00 钟创造出来的。自从被上帝创造出来以后，地球上的生命没有发生任何变化。人们相信世界是上帝有目的地设计和创造的，是有序协调、安排合理、美妙完善且永恒不变的。 “十二五”普通高等教育国家级规划教材拉马克的用进废退观点环境变化了，生物有的器官由于经常使用而发达，有的器官则由于不用而退化，这就是“用进废退”。这种由于环境变化而引起的变异能够遗传下去，这就是“获得性遗传”。长颈鹿

2、的祖先预部并不长，由于干旱等原因。在低处已找不到食物，迫使它伸长脖颈去吃高处的树叶，久而久之，它的颈部就变长了。一代又一代，遗传下去，它的脖子越来越长，终于进化为现在我们所见的长颈鹿。“十二五”普通高等教育国家级规划教材英国生物学家达尔文经过数年的环球考察，提出了著名的进化论观点。用大量事实证明“物竞天择，适者生存”的进化论思想。南美洲海岸的加拉帕戈斯群岛，岛上有多种巨大的海龟“十二五”普通高等教育国家级规划教材生物学家Schleiden和Schwann经过多年的研究观察，提出了细胞学说，认为所有生命组织的基本组成单位是形态相似分化不同的细胞，从而将宏观的生命现象带入微观世界，将生命活动归结为

3、组成生物体的细胞活动的总和。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Mendel，经多年的豌豆杂交实验，分析归纳得出两条基本的遗传规律，并提出了真正主宰生命遗传现象的基本单位遗传因子（heredictary factor）。Gregor Mendel (1822-1884).The Father of Genetics“十二五”普通高等教育国家级规划教材Morgan进一步发展和完善了遗传规律，提出了基因学说，将遗传现象与细胞内的特定物质基因联系起来，并特别指出基因是组成物种的独立要素。至此基因成为遗传研究的重要内容。“十二五”普通高等教育国家级规划教材一、基因的概念及其分子与结构基础1基因的概念与

4、本质 1909年，丹麦生物学家 W. Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因（gene）一词，用来代替Mendel提出的“遗传因子”（一种抽象的遗传单位或符号）。 Morgan等人经过多年的果蝇杂交研究，将基因与生物体中某一特定的染色体联系起来。 人们对基因的化学本质、结构特征以及基因如何控制遗传性状等仍一无所知。“十二五”普通高等教育国家级规划教材最早用实验证明基因的化学本质的是微生物学家Avery。在他所进行的肺炎球菌的转化实验中，将有毒的肺炎球菌的DNA与无毒的肺炎球菌混合培养，能使无毒的肺炎球菌获得有毒的性状。这一实验有力地证明了DNA是细菌性状发生转化的原因，从而在

5、理论上确立了DNA分子就是遗传信息及基因的载体。几年之后，Hershey等进一步证实了这一观点。“十二五”普通高等教育国家级规划教材同位素标记证实DNA是遗传信息的载体“十二五”普通高等教育国家级规划教材2基因的分子基础现代分子生物学研究已经证实DNA是遗传信息的主要载体，基因的化学本质就是一段DNA分子片段。Watson和Crick提出的DNA分子双螺旋结构模型为遗传信息传递提供了物质结构基础。根据这个模型，DNA分子是由2条互补的多核苷酸链相互缠绕而成，2条链之间通过碱基配对结合在一起。“十二五”普通高等教育国家级规划教材2基因的分子基础“十二五”普通高等教育国家级规划教材基因作为一个遗传

6、功能单位，它所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron）。显然，一个顺反子编码一种完整多肽链。因此，顺反子是一个功能单位。基因和顺反子这两个术语常被等同使用，但仔细分析，两者是有区别的：在原核细胞和低等真核细胞中，基因和顺反子是等价的；而在高等真核细胞中，由于基因中内含子的存在，此时顺反子等价于真核基因的外显子。“十二五”普通高等教育国家级规划教材二、基因克隆的概念与基本步骤1基因克隆的概念 1972至1973年，以H. Boyer和P. Berg等人为代表的一批科学家发展了有关重组DNA的技术，并于1992年得到了第一个重组DNA分子；S. Cohen和H. Boyer等于1973年

7、完成了第一个基因的克隆，由此宣告了基因克隆技术的诞生。“十二五”普通高等教育国家级规划教材从左至右分别是：P. Berg、H. Boyer、S. Cohen“十二五”普通高等教育国家级规划教材“克隆”（clone）一词作名词使用时是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的群体；作动词使用时，是指产生这一群体的过程。基因克隆是指在体外，借助于能自我复制的载体分子，将目的基因引入到宿主细胞中进行增殖，以获得大量纯一的特定DNA片段的过程。同义词包括：重组DNA，分子克隆，遗传工程, 基因工程等“十二五”普通高等教育国家级规划教材A 重组DNA技术 重组DN

8、A技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。“十二五”普通高等教育国家级规划教材B 基因工程的基本定义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。“十二五”普通高等教育国家级规划教材C 重组DNA技术与基因工程的基本用途分

9、离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种“十二五”普通高等教育国家级规划教材大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程天然细胞天然细胞生物活性物质生物活性物质“十二五”普通高等教育国家级规划教材基因工程的基本步骤（1）获得目的基因的DNA片断。（2）DNA片段与载体连接，构建成重组DNA分子（重组体）。（3）重组体转移到宿主细胞。（4）筛选获得含重组体的受体细胞（称为重组子）。（5）分析鉴定。（6）构建高效、稳定基因工程细胞。（7）大规模培养基因工程细胞，获得大量的外源基因表达产物。（8）

10、表达产物的分离纯化，获得基因工程产品。“十二五”普通高等教育国家级规划教材基因工程的基本步骤三 基因工程的发展历程第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程“十二五”普通高等教育国家级规划教材1866年奥地利遗传学家孟德尔(Gregor Mendel)根据豌豆杂交实验发现生物的遗传基因规律，提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律1909年丹麦植物学家和遗传学家约翰逊(Wilhelm Johannsen)首次提出“基因”这一名词，用以表达

11、孟德尔的遗传因子概念1944年美国细菌学家(Oswald Avery)分离出细菌的DNA（脱氧核糖核酸），并发现DNA是携带生命遗传物质的分子1953年美国生化学家华森(James Watson)和英国物理学家克里克(Francis Crick)宣布他们发现了DNA的双螺旋结构，奠下了基因工程的基础1969年科学家成功分离出第一个基因。1973年美国科学家P. Berg，H. W. Boyer，S. Cohen发明重组DNA技术1975年英国生物化学家Frederick Sanger等发明了快速的DNA序列测定技术1980年科学家首次培育出世界第一个转基因动物转基因小鼠1983年科学家首次培育

12、出世界第一个转基因植物转基因烟草1988年美国生化学家Kary Mullis发明了PCR技术1990年美国与世界多国科学家启动被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划1996年英国科学家伊恩威尔默特(Ian Wilmut)第一只克隆羊诞生1999年国际人类基因组计划联合研究小组宣布完整破译出人体第22对染色体的遗传密码，这是人类首次成功地完成人体染色体完整基因序列的测定。2001年中、美、日、德、法、英6国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。首次公布人类基因组草图“基因信息”2005年美国国立卫生研究院(National Institutes of Heal

13、th，NIH)启动的肿瘤基因组计划诞生，耗资1亿美元试点研究人类基因与癌症之间的联系2010年美国生物学家克雷格文特尔(J. Craig Venter)报道在实验室中重塑“丝状支原体丝状亚种”的 DNA，并将其植入去除了遗传物质的山羊支原体体内，创造出历史上首个“人造单细胞生物”四、基因工程的研究内容（1）基因工程载体的研究 有原核载体和真核载体；有克隆载体和表达载体；有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体及其他载体等。基因工程载体的研究是基因工程研究的重要内容之一。1基因克隆工具的研究“十二五”普通高等教育国家级规划教材（2）工具酶的研究主要包括：限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶各种修饰酶

14、1基因克隆工具的研究“十二五”普通高等教育国家级规划教材（3）基因工程受体系统的研究受体是载体的宿主，是外源基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。目前最常用的受体系统是大肠杆菌受体系统和酵母受体系统。其他受体系统：链霉菌、芽孢杆菌、丝状真菌及动物细胞。利用动物的组织（如：乳腺组织、胚胎组织等）作为受体进行基因表达的研究等1基因克隆工具的研究“十二五”普通高等教育国家级规划教材以PCR为基础的差异筛选技术长片段的DNA序列测定技术高通量的基因芯片技术借助计算机和互联网的生物信息技术，等等2基因克隆技术的研究“十二五”普通高等教育国家级规划教材基因是一种有限的重要战略

15、性资源人类基因组计划中科学家们的最新研究结果，人类基因总数比预期的低得多，初步定位在2.64.0万个之间，如此少的基因自然成为激烈竞争的对象。3克隆对象目的基因的研究我国科学家完成的水稻基因组测序研究成果发表在国际权威的SCIENCE杂志“十二五”普通高等教育国家级规划教材基因工程药物高新技术产业新的药业革命1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场。已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态美国生物技术公司已有2000多家，欧洲共有约1000家2000年，基因工程药品全世界年销售额600亿美元。前九位的分别是：单克隆抗体、疫苗、基因治疗、白介素、干扰素、生长因子、重组可溶性受

16、体，反义药物和人生长激素。4基因工程产品的研究“十二五”普通高等教育国家级规划教材2014年全球转基因作物在各国的种植面积（百万公顷）五、基因工程的安全性问题转基因植物中的具有某种抗性的基因有可能通过杂交转移到其野生或半驯化种中去，这种转移的结果是在特定条件下将增强这些植物杂草化的特性，并最终造成生态环境的破坏。（1）生态环境方面“十二五”普通高等教育国家级规划教材四、基因工程的安全性问题转基因植物（动物）一般都具有某种优势特征，因此在自然环境中，将有可能通过改变物种间的竞争关系而破坏原有自然生态平衡。如：一棵抗吃种子害虫的转基因松树会由于种子抗虫而大量保留下来，最终在数量大大超过其它物种，导

17、致森林群落遭到破坏。（2）生物多样性方面“十二五”普通高等教育国家级规划教材四、基因工程的安全性问题转基因生物作为食品进入人体，很有可能出现某些毒理作用和过敏反应。儿童饮用转基因大豆豆浆产生过敏反应，转基因西红柿导致厨师过敏的事件；转基因猪虽然比正常猪大一倍，出肉量也多一倍，但百病缠身，患有胃肿瘤、肺炎、心力衰竭和关节畸形，因此人食用后也存在患病的可能（3）影响人体健康方面“十二五”普通高等教育国家级规划教材四、基因工程的安全性问题1992年召开联合国环境与发展大会后，签署的两个纲领性文件21世纪议程和生物多样性公约，专门提到了生物技术安全问题。2000年5月15日至26日在内罗毕签署生物多样

18、性公约卡塔赫纳生物安全议定书我国1990年制定的基因工程产品质量控制标准1993年12月发布了基因工程安全管理办法（）国际社会的广泛关注“十二五”普通高等教育国家级规划教材思考题1.简述微生物学家Avery的细菌转化实验。2.顺反子（cistron）的概念（或基因与顺反子的关系）3基因的概念4简述基因工程（基因克隆）的基本步骤。 5简述基因工程的研究内容 “十二五”普通高等教育国家级规划教材2.顺反子（cistron）的概念（或基因与顺反子的关系）基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子，一个顺反子编码一种完整的多肽链。（因此，顺反子是一个功能单位）在原核细胞和低等真核细胞中，基因和顺反子是等价

19、的；而在高等真核细胞中，由于基因中内含子的存在，此时顺反子等价于真核基因的外显子。3基因的概念基因是编码蛋白质和RNA分子的基本遗传单位，化学上，基因是一段具有特定结构与功能的连续的脱氧核苷酸序列；结构上，基因由多个不同的区域组成。“十二五”普通高等教育国家级规划教材第 二 章基因与基因表达调控第 一 节基因的结构与功能1基因的分子基础现代分子生物学研究已经证实DNA是遗传信息的主要载体，基因的化学本质就是一段DNA分子片段。Watson和Crick提出的DNA分子双螺旋结构模型为遗传信息传递提供了物质结构基础。根据这个模型，DNA分子是由2条互补的多核苷酸链相互缠绕而成，2条链之间通过碱基配

20、对结合在一起。基因作为一个遗传功能单位，它所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron）。显然，一个顺反子编码一种完整多肽链。因此，顺反子是一个功能单位。基因和顺反子这两个术语常被等同使用，但仔细分析，两者是有区别的：在原核细胞和低等真核细胞中，基因和顺反子是等价的；而在高等真核细胞中，由于基因中内含子的存在，此时顺反子等价于真核基因的外显子。2基因的结构结构上，基因由多个不同的区域组成。无论是原核基因还是真核基因，都可划分为编码区和非编码区两个基本组成部分。编码区是可以被转录的区域，由连续的密码子组成，其中包括起始密码（通常是AUG）和终止密码（UAA、UAG和UGA）。编码区中包含5

21、端的非翻译区（5 UTR）和3 端的非翻译区（3 UTR）典型的编码蛋白质的原核基因结构示意图典型的编码蛋白质的真核基因结构示意图启动子（promoter）：是位于基因5 端上游紧靠转录起点的一段非编码序列，其功能是引导RNA聚合酶与基因相应部位的正确结合，启动基因的转录。一般来说，原核基因的启动子比较简单，只有数十个碱基组成，而真核基因的启动子较大，可能涉及数千个碱基。终止子（terminator）：基因3端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸短序列，具有终止转录的功能。即一旦RNA聚合酶完全通过了基因的转录单位后，聚合酶就不能继续向前移动，使转录活动终止。3原核生物基因结构与调控模

22、式 操纵子(operon) 机制编码序列 启动序列 操纵序列 其他调节序列(promoter)(operator)由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，他们相互协调，共同控制着信息区中三个酶的编码基因的表达 3真核生物基因结构与调控模式1) 顺式作用元件(cis-acting element)可影响自身基因表达活性的DNA序列BADNA编码序列转录起始点不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列 ，如TATA盒、CAAT盒等，这些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。 2) 真核基因的调节蛋白还有蛋白质因子可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因

23、的表达，称顺式作用。由某一基因表达产生的蛋白质因子，通过与另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，调节其表达。 反式作用因子(trans-acting factor) 这种调节作用称为反式作用。 cDNAaDNA反式调节C顺式调节 mRNA C蛋白质CBA mRNA蛋白质AA启动子启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子有方向性，位于结构基因转录起始点的上游，本身并不被转录。 TATA盒（TATA box）是主要的真核生物的启动子元件，它位于转录起始点上游-25bp处，几乎所有已发现的真核生物基因的启动子都有此序列。TATA盒与一种称为TATA因子的转录因子结合后即成为完整的启动

24、子，精确地决定RNA合成的起始位点 上游启动子元件上游启动子元件（upstream promoter elements）是TATA盒上游的一些特定的DNA序列。反式作用因子可与这些元件结合，通过调节TATA因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合及转录起始复合物的形成（转录起始因子与RNA聚合酶结合）来调控基因的转录效率。 包括CAAT盒、CACA盒及GC盒等。 反应元件（response elements）是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的DNA序列。反应元件都具有较短的保守序列。这些元件通常位于启动子附近和增强子内，如热休克反应元件（heat shock respons

25、e element，HSE）糖皮质激素反应元件（glucocorticoid response element，GRE）。 增强子（enhancer）增强子 是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。反应作用因子与这些元件结合后能够调控（通常为增强）邻近基因的转录。增强子一般位于转录起始点上游-100-300bp处，但在基因之外或某些内含子也有增强子序列。 4特殊结构与功能的基因转位基因，也称转位因子（transposable elements），是指可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分，因此有些文献形象地称之为跳跃

26、基因（jumping genes）转位基因最早由美国冷泉港实验室的女科学家B.McClintock，于上世纪40年代晚期在玉米中首次发现。 原核生物的转位因子分三种不同的类型： 插入序列：分子量小于2000bp 转座子：大于2000bp 可转座的噬菌体：如，噬菌体Mu和D108 。假基因（pseudogene） ： 因碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性多肽的基因。假基因4个显著特点： 没有内含子；具有与mRNA 的poly(A)尾的相应结构；两侧有顺向重复序列；随机出现在非正常的位置。 重叠基因（overlapping genes） 或称嵌套基因（nested

27、genes），其基因的核苷酸序列是彼此重叠。基因家族（gene family）就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因 。（1）核酸序列相同 即多拷贝基因。 如rRNA基因，tRNA基因等 。（2）核酸序列高度同源 如人类生长激素基因家族：人生长激素(hGH)、人胎盘促乳素(hCS)和催乳素(prolactin)。 （3）编码产物具有同源功能区 ： 如src癌基因家族，基因产物都含有250个氨基酸顺序的同源蛋白激酶结构域。 （4）编码产物具有小段保守基序 ： 如DEAD盒基因家族的产物都具有解旋酶的功能，其结构特征是8个氨基酸序列，内含DEAD序列：Asp-Glu-Ala-

28、Asp。 基因超家族（gene superfamily）是指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族。 它们可能起源于相同的祖先基因，但是它们的功能并不一定相同(区别于多基因家族）。 第二节 基因组的结构与功能一、病毒基因组二、原核生物基因组三、真核生物基因组四、线粒体基因组五、人类基因组* 基因组(genome)一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。一、病毒基因组的结构与功能特点1不同病毒基因组大小相差较大 乙肝病毒（HBV）DNA为3.2kb痘病毒基因组DNA长达300kb2不同病毒的基因组可以是不同结构的核酸 腺病毒基因组为线性双链DNA 3病毒基因组有连续的也有不连续的流感

29、病毒由8条单链RNA分子构成 4病毒基因组的编码序列大于90% 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有很小的一部分不编码蛋白质。5单倍体基因组 除逆转录病毒基因组有两个拷贝外，至今发现的病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。6基因有连续的和间断的 感染细菌的病毒（噬菌体）基因组与细菌基因组结构特征相似，基因是连续的；而感染真核细胞的病毒基因组与真核生物基因组结构特征相似，有的基因含有内含子，基因是间断的。 7相关基因丛集 如腺病毒晚期基因编码表达的12种外壳蛋白，在晚期基因转录时是在1个启动子作用下生成多顺反子mRNA，然后加工成各种mRNA，编码病毒的各种外壳蛋白，它们在

30、功能上都是相关的。 8基因重叠 有些病毒核酸分子很小，又需要装入尽可能多的基因，因此在进化过程中形成了重叠基因，即同一段核酸序列能够编码2种或2种以上蛋白质。 9病毒基因组含有不规则结构基因 主要类型有： 几个结构基因的编码区无间隔，而是连续 的、不间断的。 mRNA没有5端的帽结构 。 结构基因本身没有翻译起始序列 二、原核生物基因组的结构与功能特点1具有操纵子结构 这是原核基因组的一个突出的结构特点。所谓操纵子由信息区和调控区组成，前者包括数个编码蛋白质的序列，后者包括启动子、操纵基因，以及下游的转录终止信号。2编码序列在基因组中约占50% 原核生物基因的编码序列在基因组中约占50%，远大

31、于真核基因组，但又小于病毒基因组；编码顺序不重叠，其转录产物多为多顺反子结构。3多顺反子结构，无内含子 原核基因是多顺反子结构，同时基因内无内含子，是连续的，因此转录后不需要剪切。4基因组中重复序列很少 原核基因很少重复序列，其结构基因多为单拷贝，只有编码rRNA的基因往往是多拷贝的，这有利于核糖体的快速组装。5存在移动基因 原核基因组中存在着可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。三、真核生物基因组结构与功能的特点 真核基因组结构庞大哺乳类动物基因组DNA 约 3 10 9 碱基对编码基因约 有 40000 个，占总长的6 %rDNA等重复基因约 占 5% 10%1多条染色体，两份同源的基

32、因组 配子（精子和卵子）为单倍体，体细胞一般为双倍体，即含两份同源的基因组，而原核生物的基因组则是单拷贝的。2基因组庞大、复杂 真核基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起点。3单顺反子结构 （monocistron） 即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。 4非编码顺序占绝大部分，含有大量重复顺序 真核生物基因组内非编码的顺序占90%以上。这是与细菌、病毒的重要区别，且在一定程度上也是生物进化的标尺。6具有内含子结构，普遍存在选择性剪接 大多数真核生物的结构基因具有内含子结构，是断裂基因。7有基因家族 功能相关的基因可串联在一起，构成各种基因家族。 四、线粒体基因

33、组一个细胞里有许多个线粒体，而且一个线粒体里也有几份基因组拷贝，所以一个细胞里也就有许多个线粒体基因组。 真核细胞内存在两个遗传系统，一个在细胞核内，一个在细胞质内，各自合成一些蛋白质和基因产物，造成了细胞核和细胞质对遗传的相互作用；但是，核基因在生物体的遗传控制中仍起主宰作用 。五、人类基因组（一）人类基因组DNA的多态性 DNA序列存在着多态性(polymorphism)，这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性和长度多态性。 （二）人类基因组的重复序列 1反向重复序列 是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。 人类基因组约含5%的反向重复序列，散布于整个基因组中，常见于基因组调控

34、区内，可能与复制的调控有关。2串联重复序列 （tandem repeats） 其特点是具有一个固定的重复单位，该重复单位头尾相连形成重复顺序片段，约占整个人类基因组的10%。第三节 基因的表达与调控一、基因表达的概念基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。* 基因表达(gene expression)基因表达是受调控的二、基因表达的时间性及空间性（一）时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性(temporal specificity)。 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。

35、（二）空间特异性基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity)。三、基因表达的方式按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：（一）组成性表达某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很

36、小。区别于其他基因，这类基因表达被视为组成性基因表达(constitutive gene expression)。（二）诱导和阻遏表达在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。 如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达(coordinate expression)，这种调节称为协调调节(coordinate r

37、egulation)。四、基因表达调控的生物学意义（一）适应环境、维持生长和增殖（二）维持个体发育与分化五、基因表达调控的基本原理（一）基因表达的多级调控基因激活转录起始 转录后加工mRNA降解蛋白质降解等蛋白质翻译翻译后加工修饰（二）基因转录激活调节基本要素基因表达的调节与基因的结构、性质，生物个体或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关。1. 特异DNA序列和调节蛋白质原核生物 蛋白质因子 操纵子(operon) 机制特异DNA序列编码序列 启动序列 操纵序列 其他调节序列(promoter)(operator)是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。1) 启动序列

38、RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT共有序列共有序列(consensus sequence) 决定启动序列的转录活性大小。某些特异因子（蛋白质）决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。2 操纵序列 阻遏蛋白(repressor)的结合位点当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DN

39、A向前移动 ，阻碍转录。启动序列编码序列操纵序列pol阻遏蛋白3) 其他调节序列、调节蛋白例如：激活蛋白(activator)可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。有些基因在没有激活蛋白存在时，RNA聚合酶很少或完全不能结合启动序列。(1) 螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix） 这种结构模式具有两个较短的螺旋片段，每个片段有7至9个氨基酸残基，两个螺旋片段之间有转角结构联系。一个螺旋被认为是识别螺旋，含有较多能与DNA相互作用的氨基酸残基，此螺旋进入DNA双螺旋结构的大沟。2. DNA与蛋白质之间的相互作用(2) 锌指（zinc

40、 fingers） 锌指结构含有约30个氨基酸残基，其中 4个氨基酸残基（两个是半脱氨酸两个是组氨酸，或4个都是半脱氨酸）以配位键与Zn2+相互作用，如图2-6所示。 锌指能与DNA双螺旋大沟结合。 2. DNA与蛋白质之间的相互作用(1) 亮氨酸拉链（leucine zippers） 这种结构是指在一段肽链中每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸残基，这段肽链所形成的-螺旋就会出现一个由亮氨酸残基组成的疏水面，而另一面则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。 (2) 螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix） 六、原核生物的基因表达调控调节的主要环节在转录起始（一）原核基因转录调节1. 因子

41、决定RNA聚合酶识别特异性2. 操纵子模型的普遍性3. 阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性特点：乳糖操纵子调节机制1. 乳糖操纵子(lac operon)的结构 调控区CAP结合位点启动序列操纵序列 结构基因Z： -半乳糖苷酶Y： 透酶A：乙酰基转移酶ZYAOPDNAmRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时2. 阻遏蛋白的负性调节阻遏基因mRNA阻遏蛋白有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录mRNA乳糖半乳糖-半乳糖苷酶+ + + + 转录无葡萄糖，cAMP浓度高时有葡萄糖，cAMP浓度低时3. CAP的正性调节ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAP4. 协调调节 当

42、阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用； 如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。 mRNA低半乳糖时高半乳糖时 葡萄糖低 cAMP浓度高 葡萄糖高cAMP浓度低RNA-polOOOOTrp Trp 高时 Trp 低时 mRNA OPtrpR调节区 结构基因 RNA聚合酶 RNA聚合酶 ?其他转录调节机制1. 转录衰减色氨酸操纵子UUUUUUUU调节区 结构基因 trpROP

43、前导序列 衰减子区域 UUUU前导mRNA1234衰减子结构 第10、11密码子为trp密码子 终止密码子 14aa前导肽编码区: 包含序列1 形成发夹结构能力强弱： 序列1/2序列2/3序列3/4 trp 密码子 UUUUUUUU34UUUU 334核糖体 前导肽 前导mRNA1.当色氨酸浓度高时 转录衰减机制 125 trp 密码子 衰减子结构就是终止子可使转录前导DNA UUUU 3 RNA聚合酶 终止UUUU342423UUUU核糖体 前导肽 前导mRNA 15 trp 密码子 结构基因前导DNA RNA聚合酶 2.当色氨酸浓度低时 Trp合成酶系相关结构基因被转录 序列3、4不能形成

44、衰减子结构 2. 基因重组沙门菌鞭毛素基因的调节 H2鞭毛素 阻遏蛋白 Hin重组酶转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列3. SOS反应 SOS基因紫外线激活Rec ALex A阻遏蛋白 与DNA 损伤修复有关的酶和蛋白质基因表达Lex A阻遏蛋白操纵序列DNA（二）原核基因翻译水平的调控调节作用包括： SD序列对翻译的影响； mRNA的稳定性； 翻译产物对翻译的影响原核生物mRNA的5 端 起始密码子AUG的上游310碱基处有一个核糖体结合位点，依发现者的名字命名为Shine-Da1garno序列，简称SD序列。SD顺序富含嘌呤核苷酸，能与核糖体小亚基的

45、 16s rRNA 3末端富含嘧啶的序列互补，而使核糖体与mRNA结合。1. SD序列对翻译的影响与翻译起始有关原核生物细胞mRNA通常是不稳定的，极易被降解。如Ecoli的许多mRNA在 37时条件下的平均半衰期大约为2分钟。mRNA的快速降解使得许多蛋白质翻译的模板在几分钟内就被全部替换，这意味着，诱导基因表达的因素一旦消失，蛋白质的合成就会迅速停止。2. mRNA的稳定性有些mRNA编码的蛋白质，本身就是在蛋白质翻译过程中发挥作用的因子。这些因子可对自身的翻译产生调控作用。如：原核生物中的起始因子3（IF-3），当它合成过多时，能有效地校正和抑制其自身的起始密码子与起始tRNA的配对而抑

46、制翻译的起始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。3. 翻译产物对翻译的影响七、真核生物的基因表达调控真核生物基因表达调控与原核生物的区别至少4个方面不同： 转录激活与转录区染色质特定结构相关联； 以更加灵活，经济，便捷的正控制调节方式为主； 转录与翻译在时间与空间上是的分离的； 有更多、更复杂的调控蛋白参与调控过程（一）真核基因表达调控特点1. RNA聚合酶2. 活性染色体结构变化（1） 对核酸酶敏感活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。（2） DNA拓扑结构变化天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在；基因活化后，RNA-pol正超螺旋负超螺旋转录方向（3）DNA碱基

47、修饰变化真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化，甲基化范围与基因表达程度呈反比。（4）组蛋白变化 富含Lys组蛋白水平降低 H2A, H2B二聚体不稳定性增加 组蛋白修饰 H3组蛋白巯基暴露3. 正性调节占主导4. 转录与翻译分隔进行5. 转录后修饰、加工（二）DNA水平的调控（1）染色质（chromatin）结构影响基因表达是真核生物基因的特有现象。（2）真核生物基因通常与组蛋白结合成核小体结构，经高度螺旋压缩成的染色质储存于细胞核内，维持基因组稳定性，保护DNA免受损伤，关闭基因的转录。去除组蛋白后，染色质松弛，核小体解体，基因转录开启。（3）转录较为活跃的区域，组蛋白相对缺乏，对核酸酶（DN

48、ase）高度敏感，出现DNase超敏位点。1. 染色质结构对基因表达的调控作用（1）基因的甲基化与基因的表达负相关（2）DNA中的胞嘧啶经甲基化成为5甲基胞嘧啶（m5C），常出现在基因5端侧翼序列的CG富含区。因此，转录活性高的基因CG富含区中甲基化程度一般较低。（3）甲基化影响基因表达的机制：影响DNA与转录因子的结合，使基因不能转录或阻止转录复合物的形成。2. 基因修饰基因重排（gene rearangement）是指某些基因片段改变原有的序列，通过调整有关基因片段的衔接序列，重新组成一个完整的转录单位。免疫球蛋白分子就是由许多基因片段进行重排和拼接加工的产物。通过不同的组合方式可以形成约

49、108种不同的免疫球蛋白分子，这也是免疫球蛋白分子的多样性的分子生物学基础。基因重排是DNA水平调控的重要方式之一。3. 基因重排细胞在发育分化或环境改变时，由于对某种基因产物的需要量剧增，单纯靠调节其表达活性不足以满足需要时，常通过基因扩增（gene ampification）的调节方式来增加这种基因的拷贝数，满足需要。4. 基因扩增（三）真核基因转录水平调节1. 顺式作用元件 启动子真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。TATA盒GC盒CAAT盒真核生物基因5端启动子的顺式调控元件示意图转录方向以箭头表示，+1表示转录起始

50、点增强子(enhancer)指远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性、增强启动子转录活性的DNA序列。沉默子(silencer)某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。2. 反式作用因子 转录调节因子分类（按功能特性）* 基本转录因子(general transcription factors)是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。* 特异转录因子(special transcription factors)为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。转录激活因子转录抑制因子转录调节

51、因子结构DNA结合域转录激活域TF蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域） 谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域3. mRNA 转录激活及其调节polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBP 真核RNA聚合酶在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物TATA DNATBP相关因子真核基因转录调节是复杂的、多样的 * 不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式； * 多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。 * 转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。真核基因转录调节小结： （1）反式作用因子调节转录起始，其作用通过数量改变（合成或降解）或

52、活性改变（如：磷酸化去磷酸化等）； （2）反式作用因子通过与顺式元件的结合的方式发挥调节作用。 （3）普遍存在多种反式作用因子的组合式调控作用。（三）转录后水平调控转录后水平的调控一般是指前体mRNA产物的修饰、加工，主要包括mRNA“加帽”，“加尾”，“剪接”、胞内定位以及mRNA稳定性调节等环节。1. “加帽”和“加尾”的调控 真核生物mRNA的初级转录产物经过加帽（capping ）过程，在5端形成一个特殊结构，7-甲基鸟苷三磷酸（m7GpppN）。（1）帽子结构对维持mRNA稳定，防止mRNA被核酸酶降解具有重要作用。（2）此外，帽子结构也为蛋白质合成提供识别标志，从而促进蛋白质合成起

53、始复合物的生成，提高翻译效率。“加帽”： 真核生物中除组蛋白基因的mRNA外，其他结构基因的成熟mRNA的3端都有50150个腺苷酸组成的多聚腺苷酸尾，即poly(A)尾。它是在转录后加上去的，这一过程称为加尾（tailing）。（1）绝大多数结构基因的最后一个外显子中都有一个保守的AATAAA序列，连同此位点下游的一段GT丰富区，或T丰富区，共同构成poly(A)加尾信号。（2）poly(A)具有保持mRNA稳定，延长mRNA寿命的功能。“加尾”2. mRNA选择性剪接对表达的调控选择性剪接（alternative splicing）： 内含子与外显子的概念是相对的，外显子（一个或几个）可以

54、在成熟的mRNA中保留，也可通过剪接过程除去；同样，内含子也可能被保留在成熟的mRNA中。 通过选择性剪接，可以使一个基因在转录后产生两个或两个以上的mRNA，由此翻译成2个或更多的同源异型蛋白质（isoform protein）。3. RNA编辑的调控RNA编辑（RNA editing）： RNA编辑（RNA editing）是一种较为独特的遗传信息加工的方式，即转录后的mRNA在编码区发生核苷酸修饰改变的现象。 编辑导致mRNA模板信息的改变，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。编辑方式：（1）核苷酸替换；（2）核苷酸的插入或缺失4. mRNA转运调节mRNA通过核膜孔是主动运输过程，受到细

55、胞调控；同时，大多数的mRNA需经过加帽、加尾，并在剪接完成后才能被运输。mRNA通过核膜孔转运至胞质中的位置也具有特异性。有的被直接运到内质网，在内质网膜上完成肽链的合成；有的mRNA则可能被运到细胞浆中，由游离的核糖体进行翻译。（四）翻译水平的调控翻译水平的调控主要是控制mRNA的稳定性和mRNA翻译的起始频率。1. 翻译起始调控蛋白质生物合成过程中，起始阶段最为重要。许多蛋白质因子可以影响蛋白质合成的起始步骤，即起始复合物的形成，如真核生物起始因子-2（eukaryotic initiation factor，eIF-2）可影响起始过程，并受磷酸化调节。2. mRNA稳定性对翻译的影响真

56、核细胞中，mRNA的稳定性差别很大。有些mRNA的半衰期长达10小时以上，而有些则只有30分钟或更短。不稳定mRNA多是编码调节蛋白的，这些蛋白的水平在细胞内变化迅速，利于调控。mRNA3端约50 bp的富含AU的序列称为ARE（AU-richelement），该元件含多次重复的AUUUA序列。ARE的存在导致poly(A)尾的脱腺苷酸化，进而mRNA被降解。（五）翻译后水平的调控信号肽的切除、多肽的修饰和剪接，这些均属翻译后水平的调控。1. 信号肽的切除信号肽（signal peptide）约由1530个疏水氨基酸残基组成，其特点为疏水性。它的作用是使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。一旦蛋白质

57、进入高尔基体，信号肽就被信号肽酶水解。切去信号肽后，前蛋白质就变为有生物学活性的蛋白质了。2. 新生肽链的修饰主要的修饰方式有磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等蛋白质的磷酸化修饰是广泛存在的一种修饰方式。通过蛋白激酶催化将ATP的末位磷酸基转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，从而改变多肽链的结构与活性。通过磷酸化和脱磷酸化可快速调节蛋白活性。许多膜蛋白、识别蛋白和分泌蛋白均带有糖基，被称为糖蛋白。这些糖基常具有重要的生理功能，如：抵御蛋白酶的攻击、增加蛋白质的水溶性等。糖基与蛋白质中天冬氨酸、丝氨酸或苏氨酸的N或O连接形成。3. 肽链的剪接与正确折叠肽链的剪接：近年来不少研究发现新合成的

58、肽链可以通过多肽的剪辑被切成数个片段，然后再按一定的顺序连接起来，形成有活性的蛋白质。空间结构的形成涉及到肽链的正确折叠。一些折叠相关的酶（如蛋白质二硫键异构酶等）及一类称为分子伴侣（molecular chaperone）的物质（如伴侣素60家族、热休克蛋白70、90家族等）对蛋白正确折叠有重要作用。肽链的折叠：1. 名词解释：转座因子（transposableelements），基因组（genome），启动子（promoter），基因（gene），终止子（terminator），断裂基因（split gene），顺式作用元件（cis-acting elements），反式作用因子（tran

59、s-acting elements），上游启动子元件（upstream promoter elements），反应元件（response elements），增强子（enhancer），转位因子（transposableelements），转座子（transposon，Tn），假基因（pseudogene），重叠基因（overlapping genes），基因家族（gene family），反向重复序列，看家基因（housekeeping gene），锌指（zinc fingers）结构，亮氨酸拉链（leucine zippers），基因重排（gene rearangement)，分子伴侣（m

60、olecular chaperone），RNA编辑（RNA editing），DNase超敏位点（DNasehypersensitive site）。2. 简述乳糖操纵子中CAP的正性调节作用机制。3. 比较原核生物基因组与真核生物基因组的结构与功能特点。4. 简述原核表达调控的主要环节和调控方式。5. 简述真核表达调控的主要环节和调控方式。思考题第四章 核酸分子的酶切、连接和修饰第一节 DNA分子的酶切一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）1、限制性核酸内切酶的发现 限制修饰系统（Restriction modification system）是存在于细菌等