基因工程的基本过程

1、基因工程主要包括几个过程:1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子；3、将重组DNA片段导入受体；4、选择目的基因；5、目的基因的表达。对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且 还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常 采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及 它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选 择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤：载体目豹基因丫构造服巫组.分r（技体十目的基因）I转化了转染&使g*重鲍分 典入寄卜:

2、细胞）表达（外源基因4寄湖地中发达）I坡囚工程内晶的分离纯化图10-3-8基因工程过程目的基因的分离和制备目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基 因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目 的基因有4条途径：1.从生物基因组群体中分离目的基因原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若 干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组 文库的方法获得目的基因。CUT列 性酶 偷序 制切别X着 雇有讽#或CUTHind 1113,Eh5,CUT图10-3-1限制性内切酶限制性内切酶(restricti

3、ve enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的， 能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种 限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有 一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物 中存在，能识别46个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某 些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此 而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌吟和胞嘧啶 甲基化（

4、-CH3）而受到保护之故。这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物 比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比 较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。人工合成目的基因DNA片段人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般 是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。PCR反应合成DNA聚合酶链式反应（PCR）是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条 件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原

5、理如下：勒的DMA :连川川 lILIlHiHIDNft祛竹Ki种1加J占，洒汹(T构仕11和DIW 解族牖承卷-接君冷却便引 物纬在到J 5 神峋1 标 MA I列L.位.诅计物包括5增的 |【林EJWA摩列-网个物pl , 32)粗袖姒的罪您所个拷W- - -rr-廷仲涧的DHA ：i前热的展台晦eivtiiiIiiriiiin站花E-的择景曲 台诫I U：. DMA I虻的 心辑叫imiiuiiiiiiHiiiiiiiiiHIHHHlllllllinuillllllllliHiHiuiiiiiiiimmiiimiiHiHiiiiiiniBiiiilumiiiHiiniiiiiiiiii苛

6、;-杵白成闵弟r关 合戒11 hi. on* ir列的 jl. r椅处iiiiiiiiiiiiimiiiiiiiiiii的拇叫图10-3-2 PCR原理图以混合的DNA片段作模板，例如，可以用cDNA基因文库做模板，在90C 高温下，作为模板的双链DNA均变性，分开成为单链DNA。在反应体系中以有两种合成的DNA小段寡聚核苷酸做引物，这两种寡核苷 酸应可以分别和特异DNA片段的正链的3末端与负链的3末端相结合。寡核 苷酸引物要在50C的温度下，才能较好的找到可以配对的正链和负链，形成互 补结合。显然，在混合DNA片段作模板的情况下，只有可以形成配对关系的DNA 链才可特异性地结合引物寡核苷酸。

7、这个过程又称为淬火。反应体系中还有高温DNA聚合酶，以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸 (4 X dNTP)。高温DNA聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌，俗称Taq酶。在70C高温下，经Taq酶催化，以四种脱氧核苷三磷酸为原料，在形成互补的引 物寡核苷酸后，迅速合成一条与模板DNA单链(正链或负链)互补结合的DNA 新链。（4）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从90oC- 50oC- 75oC，反应体 系中经历：变性（DNA双链变性生成单链）淬火（寡核酸引物和特异的DNA 模板结合，配对）一一合成（以引物为起点，合成与模板互补的DNA新链）。 每次循环约需6-10分钟。经过20次循环，能与

8、引物特异结合的那段DNA 即需要放大增殖目的DNA分子，可以扩增106倍。mRNA差异显示法获得目的基因mRNA 差异显示（mRNA differential display, DD）是 1992 年由哈佛医学 院Peng Liang等人建立的。原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA 群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再次用PCR扩增。简单的 讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。5、用机械的方法，例如超声波把基因组打成片段。（2）DNA片段和载体的连接外源基因（DNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使 进入，也会受到细胞

9、内限制性酶的作用而分解。要将外源DNA片段导入受体细胞， 必须选择适当的载体（Vector），这是关键步骤之一。载体是携带外源基因进入受体细胞的工具。作为载体的DNA分子，需具备两 项基本条件:容易进入寄主细胞；进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制 和表达；容易从宿主细胞中分离纯化。通常在基因工程中选作载体的有：质粒一一环状双链小型DNA分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制， 有的亦可用于动、植物细胞。例如：根瘤土壤杆菌所携带的Ti质粒常用作植 物细胞基因工程的载体。人工改造的质粒常用的有PBR322天然质粒，派生质粒 pmB1， psC101 等噬菌体一一常用的是入噬菌体。经构建后，常

10、用于细菌细胞。常见的有Mu噬菌体载体。病毒一一例如猿猴空泡病毒SV40常用作动物细胞基因工程的载体。粘粒（cosmid,装配性质粒），由质粒和Mu噬菌体的cos位点u或膜等构建而 成的一种大容量克隆载体。含有目的基因的DNA片段和载体DNA连接技术即DNA重组技术，其核心步骤 是DNA片段之间的体外连接，其本质是涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程。载 体为细菌中的质粒，温和噬菌体。重组DNA即载体DNA+引入的DNA。把目的基因 连接到载体上去，要经过一系列酶促反应，需要几种工具酶，这中间最为重要的 是两大类酶：DNA限制性内切酶：把载体DNA片段切开。DNA连接酶：用于连接载体和外源DNA片段

11、。此外，在构建DNA重组分子中使用的工具酶还有：DNA聚合酶、逆转录酶、DNA 修饰酶、RNA修饰酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等。1、粘性末端的连接：用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同粘性末端 的两种限制性内切酶分别消化外源DNA分子和载体，所形成的DNA末端彼此互补， 用DNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNA分子。im.DNA理摺崎临个片溟谜过嘛笔配尉祜在、起加人另种曲A片段raarrM3csram CHA即成片段二 RSa输DHA图10-3-3粘性末端的连接2、平末端的连接：可先生成粘性末端，在带平头末端的DNA片段的3-末 端加上多聚核苷酸的尾巴，在载体上加上互补的尾巴，然后用DN

12、A连接酶连接。口Tl l l l I E ： THTF 孰占f-Zarai mPMWEidG*Qmrgwedl口，Plat* in典切由rahfill ECOMI cultmm . . | GAAnCIII 11 h LlJ-J CTTAA3WTH . 一.00 I 一E队ng DMMignnc用质卷 f构建 l ?重叙DNA令孑丫irIQcne conea图10-3-4用质粒构建重组DNA分子PTwio DMA重但DNA分导U DNA构建OMS IIcnfwmMrunB4i aLwJ4:nio pklupsnruiKIrtMJa IJl pTKSy* &-to 01103 piOCJUGKl

13、. Hra-lritaA l aiuMKa v kaajfa-i *MA lI D-c?n M-srf IT* QQTH? BtWIMNFncra rJWpQElwJ Bril 14it k达。用噬菌体DNA构建重组DNA分子外源DNA片段引入受体细胞 重组体DNA分子只有导入合适的受体细胞，才能进行大量地复制，扩增和表受体细胞有多种，原核细胞、低等真核细胞生物的细胞如酵母、植物细胞、 哺乳动物细胞等。胰岛素基因工程生产就是将外源DNA导入原核细胞大肠杆菌中 进行表达实现的。兔免疫beta-球蛋白的基因通过SV40(猴病毒)作为载体，并入 侵入培养的猴肾细胞彳发，猴肾细胞就可大量产生兔beta

14、-球蛋白。通过限制性内切酶或逆转录技术可以获取包含某生物体所有基因的DNA片 段集，如果把每一个片段与载体连接并分别导入受体细胞，如大肠杆菌。这样就 能得到所有的包含该生物体全套基因的库，称之为基因文库(gene library)，对 于期中只含有一个外源DNA片段的菌群，称之为克隆(clone)。通过基因文库的 构建，就可以根据需要随时从文库中选择目的基因。基因克隆=*二暮因 ffl DNA!hm性内=dna片段|接到裁体上o o o o o o进入细胸寄主蜩检DNA图10-3-5基因文库的构建重组DNA片段导入受体细胞通常有双交换和单交换的方法。染色体DNAaJ ba 目的基因 b染色体D

15、NA罩文换目的基因a质粒DNA启动子染色体DNA目的基因整合进染色体DAN的两种方式选择目的基因通过以上方法将目的基因导入受体细胞后，还需要经过筛选，才能确定真正 所需要的目的基因。选择目的基因的方法有:1、遗传学方法，根据转基因生物体的形状来确定是否满足需要，例如对于 转基因作物，要判断这些作物是否有需要的性状，而且没有带来不利的性状。2、免疫学方法，用来判断蛋白质的功能。3、分子杂交(molecular hybridization)的方法：通常人们首先着眼于某一感兴趣的蛋白质，首先找到编码这个蛋白质的 基因，从基因文库中“钓”得该基因，然后才可进行后面的基因工程操作步骤。 首先需要制备探针

16、(probes)。探针是根据所需基因的核苷酸顺序制成一段与之 互补的核苷酸短链，并用同位素标记。下图就是用分子杂交的方法从基因文库中 钓取目的基因。同位薰标黄的晶3探外基E艾伸中务前克隆印相携图10-3-7用分子杂交的方法从基因文库中钓取目的基因4、PCR扩增在获取目的基因后，可以采用该方法可以大量扩增，得到大量的目的基 因。目的基因表达构建好的重组DNA分子进入寄主细胞的过程，称为转化。如果接受异源DNA 的细胞不是细菌，而是动物细胞或植物细胞，常常称为转染。不是所有细菌细胞或动物细胞都能接受异源DNA，只有处于感受态的细胞才 能接受异源DNA。感受态细胞通常在细胞表面有一些特异蛋白质，在细胞接受异 源DNA过程中起作用，称为感受态因子。另外，还有一系列技术方法帮助细胞 接受外源DNA。这些方法包括：适当加入磷酸钙离子、DEAE-葡聚糖、显微注 射、应用脂质体或电穿孔等。进入寄主细胞的重组DNA分子，其中的外源目的基因能否表达，表达效率 的高低，仍有很大的差别。不少基因工程工作，因表达效率不够