胎盘因子的制备及其对淋巴细胞免疫调节作用的体外研究

1、胎盘因子的制备及其对淋巴细胞免疫调节作用的体外研究【摘要】为了建立制备胎盘因子plaentafatr,PF的新方法，研究PF理化性质，并讨论PF体外应用对淋巴细胞的影响，应用超滤法制备PF，对PF的含量及各种成分的分子量进展测试，并以环孢素A(sA)为阳性对照，生理盐水(NS)为阴性对照。应用甲基噻唑基四唑TT法检测植物血凝素PHA诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反响LR；应用流式细胞术检测T细胞D69的表达；应用乳酸脱氢酶释放法测定自然杀伤NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤作用。结果说明反响的作用与环孢菌素AsA相当P0.05。PF和sA均可下调佛波酯PA+离子霉素inyin刺激后T淋巴细胞活

2、化抗原D69的表达PFvssA,P0.05。细胞杀伤试验显示，PF组NK细胞杀伤活性略高于或等于NS组P0.05，而sA组杀伤活性明显低于NS组P0.05。结论：建立了制备PF的新方法，并首次证实PF在体外对T细胞有强大的免疫抑制作用，可抑制由丝裂原及异基因抗原诱导的T细胞的增殖及活化，而且并不影响甚或促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。这一结果说明，PF在抑制移植物抗宿主病GVHD的同时，或答应以较好地保存移植物抗肿瘤效应GVT，是一种较理想的、有应用潜能的抗GVHD制剂。【关键词】胎盘因子淋巴细胞环孢菌素AT细胞；NK细胞免疫调节作用PreparatinfPlaentaFatrandItsIun

3、regulatryEffetsnLyphytesInVitrKeyrdsplaentafatr;lyphyte;ylsprinA;Tell;naturalkillerell;iunregulutryeffetJExpHeatl2022;15(3):567-572胎盘组织功能复杂，是母体和胎儿之间的免疫屏障。许多学者证实，胎盘中的大分子蛋白胎盘球蛋白，以及胎盘组织培养上清、胎盘提取物等蛋白质成分的混合物，均可以抑制淋巴细胞的增殖与活化1-4。胎盘因子plaentafatr,PF亦称胎盘肽，是从人胎盘组织中提取的小分子多肽类物质，具有免疫调节作用5，并且在临床上用于治疗恶性肿瘤、病毒性肝炎、支气管

4、哮喘及变应性鼻炎等病也获得了较好的疗效6-10，但PF的制备一直没有标准化，亦无商品消费化。本研究建立制备PF的新方法，讨论PF的理化性质及生物学活性，比拟其与传统的免疫抑制剂环孢菌素AylsprinA,sA对T细胞及NK细胞的影响。材料安康产妇胎盘，由北京大学人民医院产科提供。搜集要求：于产后立即搜集或不超过12小时，去除筋膜血管、生理盐水冲净、剪碎备用。另外，提供胎盘的产妇均为产前乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、弓形虫及梅毒检测均为阴性的安康产妇。主要试剂及仪器PF的制备应用超滤法制备PF参考黄楚华的报道11，并做了重要改动。步骤如下：胎盘剪碎、加2倍生理盐水/V，高速匀浆2380g，

5、3分钟/次10次，37水浴孵育1小时，113g离心30分钟，上清液超滤截留分子量10kD，产物用illipre滤器220过滤除菌分装得到PF。理化性质研究蛋白质定性试验采用加热醋酸法及20%磺基水杨酸法进展蛋白质定性试验。多肽质量的测定采用Bradfrd法进展多肽质量的测定。计算公式为：多肽质量(g/g)=多肽质量浓度提取液总体积测定时取样体积胎盘组织质量生物学活性研究淋巴细胞增殖试验人外周血单个核细胞PBN接种96孔板，参加终浓度10g/l的PHA和不同制剂。试验分3组：不同稀释度的PF1/1,1/2,1/4,1/6,1/8及1/10组、不同浓度的sA组及生理盐水nralsaline,NS组

6、，同时设立单纯培养液及未加PHA的对照孔。于37、5%2孵箱中培育68小时，应用TT法检测，并计算细胞生长抑制率。生长抑制率%=1-试验孔D值无刺激孔D值100混合淋巴细胞反响不同志愿者的PBN分别作为反响细胞和刺激细胞，刺激细胞以丝裂霉素终浓度60g/l处理，将反响细胞与刺激细胞按11接种96孔板，参加不同制剂。分组情况同上，并设立单纯反响细胞、单纯刺激细胞及单纯培养基的对照孔，于37、5%2孵箱中培育6天，应用TT法检测，并计算细胞生长抑制率同上。NK细胞杀伤试验PBN接种于24孔板为效应细胞，参加不同制剂。试验分3组：不同稀释度的PF1/1,1/2,1/4,1/6,1/8及1/10组、不

7、同浓度的sA组及NS组。于37、5%2孵箱培育12小时，取出效应细胞，重新计数接种96孔板。K562细胞株接种于96孔板作为靶细胞，效靶比201，并设立效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正释放孔及培养基空白对照孔。余步骤按说明书进展，酶标仪检测D490，并计算细胞杀伤率%。公式为：细胞杀伤率=A-B-/D-100式中A=试验孔D值空白对照孔D值，B=效应细胞自发释放孔D值空白对照孔D值，=靶细胞自发释放孔D值空白对照孔D值，D=靶细胞最大释放孔D值体积校正孔D值。统计学方法用SPSS13.0统计软件包处理，实验结果用SD表示，2个以上样本均数的比拟采用方差分析F检验

8、，多个样本两两比拟采用q检验LSD法，P0.05者具有统计学意义。结果理化性质PF外观呈微黄色透明液体，pH6.8。加热醋酸法及20%磺基水杨酸法蛋白质定性为阴性。多肽质量以标准蛋白质样品的D590对标准蛋白质样品的质量浓度作图，得到回归方程，多肽质量浓度(y)=0.4591.608D590(x)，R2=0.847，P=0.001，根据待测蛋白质样品的D590，按回归方程求出PF的多肽质量为5.70-6.86g/g鲜重胎盘6.280.58g/g。生物学活性对PHA诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反响的影响PF对PHA诱导的淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用，呈剂量依赖关系图1，随PF稀释度增加，抑

9、制作用逐渐减弱各剂量组与NS组比拟P=0.000，其中1/1、1/2及1/43个剂量组与sA组比拟分别为70.03%vs67.91%P=0.401;67.80%vs67.23%P=0.744及59.33%vs67.34%P=0.104。PF对混合淋巴细胞反响也具有显著的抑制作用，亦呈剂量依赖关系图2。随PF稀释度增加，抑制作用逐渐减弱各剂量组与NS组比拟P=0.000，其中1/1、1/2、1/4及1/64个剂量组与sA组比拟分别为78.90%vs72.96%P=0.708;78.70%vs73.43%P=0.599;73.04%vs73.54%P=1.000及66.02%vs74.25%P=0.469。上述结果说明，PF在体外抑制PHA诱导的T细胞增殖和混合淋巴细胞反响的作用与sA相当。讨论本研究建立了一种制备PF的新方法，并首次证实PF体外应用对T细胞有强大的免疫抑制作用