发酵工程 4 发酵工业无菌技术

1、4发酵工业的无菌技术思考题1、发酵工业中污染杂菌的危害及其预防措施2、灭菌、消毒、除菌与防腐3、灭菌的常用方法及其机理4、湿热灭菌的理论计算5、空气灭菌的常用方法6、简述好氧发酵无菌空气制备的工艺流程与要求。什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。一、发酵工业的无菌处理 灭菌（sterilization）是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象 。消毒（disinfection）是指用化学或物理的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一般只能杀死营养细胞

2、而不能杀灭细菌芽孢。消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。除菌（degerming）是用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子 。防腐（antisepsis）就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺氧、干燥、高渗、添加防腐剂等。1）由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗而损失，造成产率的下降；2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成得率降低或使产品质量下降；3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；二、杂菌污染的危

3、害 4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。三、发酵污染及其危害的具体分析 1、染菌对不同菌种发酵的影响 细菌：发酵周期短，主要防止噬菌体的污染；营养缺陷型细菌：生长能力差，所需培养基营养丰富，易受生长较快杂菌的污染；霉菌：发酵周期较长，易染菌。对于有机酸发酵，中、后期pH较低不易发生染菌；酵母：易受生长较快的细菌及野生酵母的污染。 放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产

4、生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。不同产品链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。不同产品对疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。2、污染不同种类和性质的微生物的影响（1）污染噬菌体噬菌体的感染力很

5、强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。（2）污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。3、不同发酵时期染菌对发酵的影响（1）种子培养期染菌（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌。原因 发酵

6、前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。发酵中期染菌，处理困难，危害很大。（3）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平

7、可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响1）发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大

8、幅度降低过滤收率，直接影响提取总收率。2）发酵染菌对提取的影响染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。四、杂菌污染的防治 1、染菌的检查显微镜检查法：平板划线培养检查法：肉汤培养检查法：发酵过程的异常现象观察法：溶解氧、pH、尾气中的CO2含量、发酵液黏度、颜色等的异常变化，都可

9、能是发生染菌的重要信息。溶解氧水平的异常变化污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并接近零值，长时间不能回升；污染非好氧性杂菌，生产菌受到抑制，耗氧量减少，溶解氧升高。pH异常对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌，会使pH迅速下降。尾气中CO2含量异常污染杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。2、污染的原因分析染菌的原因复杂，包括种子带菌、空气带菌、设备渗漏、培养基或补料液灭菌不彻底、操作失误、技术管理不善等。日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.7

10、9总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.941）从污染杂菌的种类分析污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。2）从污染时间分析发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不当或空气带菌；发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。3）

11、从染菌程度分析多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；个别罐染菌：设备问题、操作不当。3、杂菌污染的途径及其预防措施1）种子带菌种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。防止种子带菌制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。无菌室要求在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓

12、度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。2）空气带菌从日本工业技术院分析空气带菌而造成的染菌为19.96。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。防止空气引起的染菌空气过滤除菌设备流程空压机储罐二级冷却加热器空气过滤器粗过滤空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。棉花-活性炭过滤器

13、长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。3）设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，

14、物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现 。试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可

15、以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。4）灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基。升温快慢、保温时间、泡沫的产生；蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料杂菌的数量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量有

16、无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。 五、发酵工业的无菌技术1化学试剂灭菌法：常用试剂有甲醛、氯气（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）、臭氧等。这些物质易与微生物细胞中的一些成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。 2辐射灭菌：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。如紫外线（穿透力低，仅适用于表面消毒和空气消毒）与菌体核酸的光化学反应而使菌体死亡；（0.01-0.14nm）的X射线、Co60产生的射线

17、，它们含极高的能量，可使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、H2O2和有机过氧化物，从而在微生物体内引起氧化连锁反应，导致微生物菌体迅速死亡。近年兴起了微波灭菌。 3过滤除菌法适用于澄清液体和气体的除菌。是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。 4高温灭菌法： 1）干热灭菌法160下保温1-2小时。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应而使菌体死亡。2）火焰灭菌法灭菌彻底，但仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。3）湿热灭菌法(工业上的蒸气灭菌装置)：湿热灭菌要比干热灭菌更有效，

18、这一方面是由于湿热易于传递热量，蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。一般的湿热灭菌条件：121，30min。高压蒸汽灭菌是发酵工业最常用的方法，能有效地杀灭杂菌，但高温也破坏培养基的营养成分。 消除高温有害影响的措施（1）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（2）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（3）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112即0.

19、57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（4）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。4)间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。灭菌设备高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多：手提式灭菌锅立式或卧式灭菌锅大型灭菌锅六、发酵培养基与设备管道灭菌某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。杂菌虽然是

20、一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。1、湿热灭菌原理对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，即 式中，N为培养基中活微生物的个数；t为微生物受热时间；k为比死亡速率。 若开始灭菌时（t0），培养基中活微生物数为N0，将上式积分可得 即 随温度的变化，比死亡速率k值有很大的变化，温度对k的影响遵循阿仑尼乌斯定律。或A阿累尼乌斯常数，1/s，对指定反应来说为一常数；E反应的活化能；R摩尔气体常数；T热力学温度。 由实验测得一微生物死亡反应在一系列不同温度

21、时的k值，以对作图，可得一直线。直线的斜率为，截距为，可求得该反应的活化能。 培养基在灭菌以前，存在各种各样的微生物，它们的k各不相同，k值越小，则此微生物越耐热。在计算时，可以对热抵抗力较大的芽孢杆菌的k进行计算，这时A可以取1.341036 s-1，E可以取2.844105J/mol，这样得到了只随灭菌温度而变的灭菌速率常数k的简化计算公式，即 若要求灭菌后绝对无菌，即N=0，则从上面公式可以看出灭菌时间t将等于无穷大，这是不可能的，故培养液灭菌后，以在培养液中还残留一定活菌数进行计算。工程上，通常以=10-3个/罐，即杂菌污染降低到被处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度，此数已满足生

22、产要求。 某发酵罐，内装培养基80m3，在121下进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个，求灭菌时间？ 影响培养基灭菌的因素 1）pH值的影响 pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.08.0时微生物最不易死亡， pH 6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。 2）培养基成分 培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。3）培养基中的颗粒物质 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较

23、大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。2、分批灭菌培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。在工业上，培养基的分批灭菌无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低（0.2-0.3Mpa表压），但因其灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，对操作难于实现自动控制。分批灭菌的过程包括升温、保温和降温三个阶段。1）培养基的预热灭菌时培养基需通过夹套或蛇管先加热到8090，然后再导入蒸汽升温至120130。预热的目的一是防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温差过大而产生大量冷凝

24、水使培养基稀释；二是防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起物料外溢。2）培养基灭菌将蒸汽从进气口、排料口或取样口直接导入罐内，使罐温上升至120130，并保温30min。3）降温关闭蒸汽，先自然冷却10分钟左右，通冷却水进行冷却，当罐内温度降至70以下时，启动搅拌桨搅拌，慢速搅动培养基，加速冷却。当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须间隙开启进气阀，让无菌空气进入发酵罐内，并使罐压保持在0.03-0.05 MPa之间，以罐内产生负压而吸入外界空气。在引入无菌空气前，罐内压力必须低于空气压力，否则罐内物料（培养基）将倒流进行空气过滤器。灭菌

25、时总蒸汽压力不低于0.3-0.4 Mpa，使用压力不低于0.2 Mpa。应该指出，在分批灭菌时，升温阶段对灭菌亦是有贡献的。 3、培养基的连续灭菌 连续灭菌就是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一般为130-140度），短时间保温（一般为5-8min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。组成培养基的不同成分（耐热与不耐热、糖与氮源）可在不同温度下分开灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。 培养基的连续灭菌具有对培养基破坏小、可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点而被广泛应用，尤其在

26、培养基体积较大时。但对加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于0.45Mpa。同时连续灭菌需要一组附加设备，设备投资大。 培养基连消工艺流程图 分批灭菌与连续灭菌的比较 灭菌方式 优点 缺点 连续灭菌 1、灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失； 2、操作条件恒定，灭菌质量稳定； 3、易于实现管道化和自控操作； 4、避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率； 5、发酵设备利用率高； 1、对设备的要求高，需另外设置加热冷却装置； 2、操作较麻烦； 3、染菌的机会多； 4、不适合于含大量固体物料的灭菌； 5、对蒸汽的要求高； 分批灭菌 1、设备要求低，不需另外的加热冷却装置； 2、操作要求低，适于手动操作； 3、适合于小批量生产规模； 4、适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌； 1、培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降； 2、需进行反复的加热和冷却，能耗较高； 3、不适合于大规模生产过程的灭菌； 4、发酵罐的利用率较低； 七、空气除菌 好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要作到绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌而造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用