蛋白表达、分离和纯化

1、蛋白质的表达、别离、纯化和鉴定来源： HYPERLINK 易生物实验 浏览次数：2704 HYPERLINK /comment/?keyid=phpcms-content-title-4468&verify=86de8f67f98f1de47414215e2bc0f73c 网友评论 0 条第一局部 蛋白质的表达、别离、纯化 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。第二局部 蛋白质的鉴定 电泳可用于别离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，

2、凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。关键词： HYPERLINK /tag.php?tag=%B5%B0%B0%D7%D6%CA 蛋白质 HYPERLINK /tag.php?tag=%B5%B0%B0%D7%D6%CA%B1%ED%B4%EF 蛋白质表达 HYPERLINK /tag.php?tag=%BF%CB%C2%A1%BB%F9%D2%F2 克隆基因 HYPERLINK /tag.php?tag=%BE%DB%B1%FB%CF%A9%F5%A3%B0%B7%C4%FD%BD%BA%B5%E7%D3%BE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 HYPERLINK /t

3、ag.php?tag=%C2%C8%C3%B9%CB%D8%F5%A3%BB%F9%D7%AA%D2%C6%C3%B8 氯霉素酰基转移酶 HYPERLINK /tag.php?tag=%CA%AE%B6%FE%CD%E9%BB%F9%C1%F2%CB%E1%C4%C6 十二烷基硫酸钠 HYPERLINK /tag.php?tag=SDS%BE%DB%B1%FB%CF%A9%F5%A3%B0%B7%C4%FD%BD%BA SDS聚丙烯酰胺凝胶第一局部 蛋白质的表达、别离、纯化目的要求1了解克隆基因表达的方法和意义。2了解重组蛋白亲和层析别离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验

4、应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌 HYPERLINK /yp/product-list-428.html t _blank 总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基 HYPERLINK /yp/product-list-483.html t _blank 转移酶蛋白，该蛋

5、白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸NTA使镍离子Ni2+固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析MCAC。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂1 LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用 HYPERLINK /yp/product-list-67.html t _blank 蒸馏水配至1000mL.2 氨苄青霉素：100mg/mL3 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM HYPERLINK /yp/product-list-702.html t _blank Tris, 8M

6、Urea, 10 mM2-ME, pH8.04 Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM HYPERLINK /yp/product-list-702.html t _blank Tris, 8 M Urea, pH6.35 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.06 IPTG易生物仪器库： HYPERLINK /yp/product-list-42.html t _blank /yp/product-list-42.html易生物试剂库： HYPERLI

7、NK /yp/product-list-43.html t _blank /yp/product-list-43.html二、器材 HYPERLINK /yp/product-list-339.html t _blank 摇床， HYPERLINK /yp/product-list-47.html t _blank 离心机，层析柱110 cm操作方法一、氯霉素酰基 HYPERLINK /yp/product-list-483.html t _blank 转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中含100ug/mL 氨苄青霉素，37

8、震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL含100ug/mL 氨苄青霉素LB液体培养基中，37震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于 HYPERLINK /yp/product-list-703.html t _blank SDS分析。3. 参加IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37继续培养1-3h.4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20或-70冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的别离，纯化1. NTA层析柱的准备：在层析柱中参加1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的

9、变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，参加5mL上样缓冲液, 用 HYPERLINK /yp/product-list-963.html t _blank 吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul 上清样品用于 HYPERLINK /yp/product-list-703.html t _blank SDS分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS分析。4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h

10、流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液，约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS分析。5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10ul样品用于SDS分析。第二局部 蛋白质的鉴定目的要求1了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。2掌握凝胶电泳实验操作规程。实验原理电泳可用于别离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。但如果参加某种试剂使电荷因素

11、消除，那么电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。十二烷基硫酸钠SDS就具有这种作用。在蛋白质溶液中参加足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键复原，蛋白质SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳漕缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括积层胶和别离胶两局部。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动参加凝胶的样品中的SDS多肽复合物向

12、前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在别离胶外表聚集成一条很薄的区带或称积层。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到别离。试剂和器材一、试剂1 30AcrBis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。2 1.5mol/L Tris(pH8.8)3 10% (w/v) SDS4 10% 过硫酸铵：4保存。5 TEMED6 3SDS凝胶加样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH6.8), 300mmol/L HYPER

13、LINK /yp/product-list-701.html t _blank DTT, 6% SDS, 0.6%溴酚蓝，30% 甘油7 5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g甘氨酸电泳级，50mL 10% SDS, 配至1000mL.8 考马斯亮蓝染液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇：水1：1和10mL冰乙酸的混合液中。9 脱色液：水：乙酸：乙醇 = 6.7：0.8：2.5二、器材DYCZ-24D型垂直板电泳槽, HYPERLINK /yp/product-list-918.html t _blank 移液管1，5，10mL， HYPERLINK /yp/

14、product-list-912.html t _blank 烧杯25，50，100mL，细长头的 HYPERLINK /yp/product-list-963.html t _blank 吸管，微量注射器10L或者50L。操作方法一、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配置：1. 安装玻璃板，检查漏液情况。2. 制备别离胶：按表1别离胶所示，依次在 HYPERLINK /yp/product-list-952.html t _blank 试管中混合各成分，一旦参加TEMED后，凝胶马上开始聚合，故应立即快速悬动混合物，迅速在两玻板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，注意流出积层胶所需空间。并在其上覆盖一层水或异丁醇

15、溶液。将凝胶垂直放置于室温下。别离胶聚合后约30min，倒出覆盖层液体，用枪将残留液体吸净。制备浓缩胶：按表1积层胶所示，依次在 HYPERLINK /yp/product-list-952.html t _blank 试管中混合各成分，一旦参加TEMED后，应立即快速悬动混合物，迅速在别离胶上灌注浓缩胶溶液，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的电泳梳，小心防止混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下。别离胶5mL水30%丙烯酰胺1.5M TrisPH8.810%SDS10%过硫酸铵TEMED1.1mL2.5mL1.3mL50l50l2l浓缩胶4mL水30%丙烯酰胺1M TrisPH8.810%SDS10%过硫酸铵TEMED2.7mL0.67mL0.5mL40l40l4l二、上样样品的处理：将样品置于1SDS 凝胶加样缓冲液中，在100加热5min使蛋白质变性。加热后3000rpm离心1min.三、 电泳：1. 浓缩胶聚合完全后约30min，将凝胶固定于电泳装置上，并参加Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后小心移出电泳梳。2. 按预定顺序加样，小心缓慢参加样品，每样品加12ul。3. 将电泳与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm,当染料前沿进入别离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达别离胶底部约4h