结核杆菌涂片检查标准操作程序

1、月亮县中医院文件编号：YCXZYYJYK_SOP_15 页码：第- PAGE 4 -页，共 4 页版本：第 3 版，第 1 次修订生效日期：20180101项目临床微生物项目 SOP 手册检验科编写者：张三三审核者：李四四批准者：李四四时间：20180101时间：20180101时间：20180101SOP_15-16结核杆菌涂片检查标准操作程序一、目的：统一项目操作规程，严格检验质量标准，为临床提供及时、可靠的结果报告。二、适用范围：结核杆菌涂片检查三、操作人员：检验科授权工作人员四、操作步骤：1、 原理抗酸染色的基本原理是抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状。此类细菌在石碳酸（苯 酚）的协

2、同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性乙醇脱色，显微镜观察时保持紫红 色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性乙醇脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。2、 染色液的配制碳酸复红染液：全省统一配送5%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸 5mL 与 95%乙醇混合亚亚甲蓝染色液：全省统一配送3、 载玻片的准备：用于 AFB 检查的载玻片要求： 一张载玻只能涂抹一份痰标本。 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB 涂片检查。新的载玻片放入95%乙醇中浸泡 2 小时脱脂，用摄子夹出放干净纱布上阴干，放无尘容器（培养皿）中备用。4、 本的采集、运送及处理初诊病人应送 3 份痰标本（夜间痰、晨痰和即

3、时痰）。如无夜间痰，在留晨痰后 2-3 小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。疗程中或复诊随访病人按期每次送 检 2 份痰（晨痰和夜间痰）。痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。收集标本的容器应采用WHO 推荐的标准痰瓶，或采用直径 4 厘米、高 2 厘米的可密封塑料盒或蜡纸盒（我省统一采用蜡纸盒）。痰容器上就注明与检验单一致的病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目和容器序号 1、2、3（1 为当日即时痰，2 为夜间痰。3 为晨痰）。5、涂片的制备编号：取经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载

4、玻片制备涂片，在玻片背面左端 1/3 处注明实验室序号(56001 递增)及标本序号（按 1 递增）（如使用的载玻片一端无磨砂面，须用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B 铅笔在磨砂面上直接书写）。制备涂片小心打开装盛痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。仔细观察标本，使用折断 的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约 0.05-0.1ml，于玻片正面右侧 2/3 处均匀涂抹成 10mm20mm 的卵圆形痰膜（新版一角硬币大小 ）。痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约 30min）进行染色镜检。涂抹完毕后的痰标本，在报告结果前应暂时保留。为保证检验人员的安全，严禁在涂

5、抹痰标本的同时对载玻片进行加热。染色：萋尼氏染色步骤 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持 10mm 以上的距离；火焰固定（在 5 秒钟内将玻片置于火焰上来回烤 4 次）。 滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色 5 分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色沸腾。 流水自玻片一端缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色 1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 滴加亚甲蓝复染液，染色 3060

6、 秒钟。 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后疬去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果 透过痰膜不能分辩报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。镜检读片:萋尼氏染色玻片镜检使用 10X 目镜双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用 40X 物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度， 调节焦距至可见细胞形态；移开 40X 物镜，在玻片上滴 1-2 滴镜油，使用 100X 油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止 AEB 交叉感

7、染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一 个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mmX20mm 的痰膜，使用 100X 油镜，每行可观察 100 个视野。仔细观察完 300 个视野，一般需要 5 分钟以上。一位镜检人员连续阅读1012 张玻片后应休息约 20 分钟。镜检结果报告:由于与疾病传染性的程度及其相应严重程度密切相关，故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。萋尼氏染色 镜检结果分级报告标准抗酸杆菌阴性：连续观察 300 个不同视野

8、，未发现抗酸杆菌。报告抗酸杆菌菌数：1-8 条/300 视野。抗酸杆菌阳性(1+)：3-9 条/100 视野。抗酸杆菌阳性(2+)：1-9 条/10 视野。抗酸杆菌阳性(3+)：1-9 条/每视野。抗酸杆菌阳性(4+)：10 条/每视野。登记报告登记前应对检验单、标本盒、涂片上的标注进行反复核对。检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“结核病细菌学实验登记本”上。镜检结果报告应及时发出，以便尽早为临床提供诊断论据。抗酸染色玻片的保存阅读完萋尼氏染色玻片后，应及时用染满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油、干燥的玻片，必须再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号涂片上

9、严禁标记镜检的阴阳性结果。全部涂片按实验室登记本序号排列放置在玻片盒中.涂片保存与实验室登记本记录应保持一致。初诊病人第1 张涂片存入涂片盒后需预留出 2 个空位置，以备第 2 张、第 3 张涂片检查放入；随仿病人第 1 张涂片存入涂片盒中后需预留出 1 个空位置，以备第 2 张涂片检查后放入。按规定数量保存的用于室间质量评估的痰片，未经上级质控单位准许不能自行销毁装满涂片的玻片盒，存放在阴凉干燥的环境中，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样6、 废弃标本及污染物的处理废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽灭菌方能丢弃或清洗；严禁不经灭菌随意处理。如需焚烧处理

10、，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底或暴露焚烧是危险的。试验操作工作面应以 3%石碳酸或其它可靠的清毒液擦拭后，再用紫外线灭菌灯（距离1m） 照射 30 分钟以上。7、抗酸染色镜检注意事项AFB 痰检假阳性结果的预防措施 必须使用新的载玻片进行相应的检查。 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。 所有染液均经过滤。 染色时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。 严禁使用染色缸染色。 染色时勿使玻片上的染液干燥。 滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。 严禁物镜镜头直接接触玻片上的痰膜。 完整、准确地标注痰盒、玻片和登记实验室登记本。 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 准确记录和报告结果。AFB 痰检假阳性结果的预防措施 确认标本是痰而非唾液。 确认每份标本至少有 3ml。 选择脓样、干酪样、黏液分泌物涂抹制备玻片。 制