材料细胞培养具体步骤

1、具体步骤：实验准备：一. 水的细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。二.各浓度醇的配制95%分析纯，用纯净水稀释到所需浓度。三.PBS 的与1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml，摇匀即成新配制的 PBS溶液。2.移入溶液瓶内待：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压蒸汽灭菌锅内30 分钟（注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份）。或用正压

2、滤器过滤除菌。四. 胰蛋白酶溶液的配制与胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在为 8.0、温度为 37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中 PBS 液中。搅拌混匀，置于 4内过夜。2.用注射滤器抽滤：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。五.青、链霉素溶液的配制与1. 所用纯净水（双

3、蒸水）需要高压 30 分钟灭菌。2.青霉素是 80位/瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100位/瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20位。3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100/ml。六.培养液的与1.溶解、调值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中,并蒸水冲洗包装袋 2-3 次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100/ml。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调到7.2 左右。最后定容至 1000ml，摇匀

4、。2. 过滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌，通常在超净工作台内过滤。3.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4冰箱内待用。实验前放入 37预热。未加液体培养基有效期为 12 个月。4.使用前要加入 10%胎牛。5.培养基中加入了酚红（当溶液酸性时小于 6.8 呈黄色；当溶液碱性时大于 8.4 呈红色），一种指示剂。七的保存与处理的使用与:正确的使用及保存，才能使发挥应有的作用。2.1 使用前处理：大部分在使用前必须灭活处理，即5630分钟。灭活的目的是去除中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提清不经灭活直接用于培养，这样做

5、的前提是确认血清中不含补体成分。2.2条件：一般于20，同时应避免反复冻融。大包装的后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，于20，使用前融化。融化时最好现置于4。融化后的在4不宜长时间存放，应尽快使用。2.3 使用浓度：最常用是10。过多容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。八. 型胶原酶：0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。九：MTT用PBS配制成5mg/ml（可以60水浴助溶），0.22um滤膜过滤除菌，然后分装在EP管里。用避光袋

6、或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，-20C长期保存，避免反复冻融。临用前4C解冻，4C避光保存两周内有效细胞实验：实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射 30-60 分钟灭菌，用75%擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转 10 分钟后，才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用 75%擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转 10分钟后，才可进行下一个实验操作。细胞传代：一.胰蛋白酶消化1.观察细胞生长数量、状态，加入消化液：吸出旧培养液，用PBS（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以

7、盖住细胞最好，最佳消化温度是37。2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。二.吹打分散细胞：1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。四.分装稀释细胞：1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。2

8、.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5105/ml。最后要做好标记。五.继续培养：用棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。96筛药：测细胞调密度至 1000-10000 孔，（边缘无菌 PBS 填充）。1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待细胞冻存：选择处于对数生长期的细胞进行冻存，在冻存前一天换一次培养液。用传代的方法对培养瓶内的细胞进行消化，把消化好的细胞收集到离心管并计数，离心 1000rpm/min,5min。去除消化液以及旧的培养液，加入配置好的冻存液，冻存

9、液中的细胞终浓度为5106/ml-1107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。每只冻存管加液 1-1.5ml。采用序列降温方法：置于 42.5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满（96 孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但常一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7 个梯度,每孔 100ul,设 3-5 个复孔.建议设 5 个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液， 用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。终止培养， 吸去 培养液。每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇 低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）其他：做完实验的玻璃制品及制品要用自来水冲洗10次，如果冲洗不掉用体外的毛刷站洗衣粉轻轻的刷，再用自来水冲洗10次，放入洗衣粉水中浸泡过夜。洗衣粉水中的瓶冲洗方法：取出洗衣粉水中的玻璃制品