分析仪器第一章

1、分析仪器第一章第1页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一主要内容1.1 紫外可见分光光度计 （自学）1.2 荧光光谱仪 （8学时） 1.3 红外光谱仪 （自学） 1.4 激光拉曼光谱仪 （2学时） 第2页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光光谱仪Spectrophotofluorimetry第3页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱 三、荧光光谱仪及主要谱参量四、荧光生色团的结构特点五、影响荧光测量的因素六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用主要内容第4页，共90页，2022年，5月20日，19点

2、42分，星期一一 荧光的发现16 世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光； 1575 年：纪西班牙的内科医生和植物学家Monardes 植物愈创木切片黄色水溶液天兰色荧光； 1852 年：Stokes 阐明荧光发射机制(分光计观测奎宁和叶绿素的荧光，发现波长稍长于入射光的波长认识到荧光为“重新发光”而不是漫射光； 1905 年：Wood 发现气体分子的共振荧光； 1926 年：Gaviola 直接测定了荧光寿命； 1923 年：荧光 X 射线光谱； 1964 年：原子荧光光谱分析的建立； 1965 年：荧光分析在生物分析中广泛应用。 第5页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（

3、一） 荧光的产生（二）荧光光谱与吸收光谱二 荧光与荧光光谱第6页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（一） 荧光的产生1 分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er Ee：价电子运动能, electron Ev：原子在平衡位置附近的振动,vibration Er：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，Ee Ev Er第7页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2表示激发三重

4、态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2.表示。三重态能级低于单重态（Hund规则）第8页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一2. 去活化过程（Deactivation） 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 。这些过程包括：1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。2）内转换（Internal Conversion，IC） 对于具有相同多重度的分子

5、，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。第9页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一3）外转换（External Conversion，EC） 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC） 系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方

6、向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。第10页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 5）荧光发射 分子电子从单重激发态（Kasha规则）的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效应）。6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。第11页，共90页，2022年，5月20日，19点42

7、分，星期一（二）荧光光谱与吸收光谱第12页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光分光光度术： 又称荧光光谱术，属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。第13页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（一）荧光光谱仪（二）荧光分光光度术中的参量三 荧光光谱仪与主要参量第14页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（一）荧光光谱仪吸收光谱仪光路图荧光光谱仪光路图第15页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，

8、星期一氢灯的能量分布氘灯的能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布1 激发光源 在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯，氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。第16页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一实践中常不选用强光源：随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多 强光源照射，容易使样品产生光化分解 强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵 产生大量臭氧，损害健康 第17页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一对于光源要注意以下几点:（1）正负极不要接错。（2） 拿灯时，不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照

9、射后，难以清除。 应及时用无水乙醇擦干净。（3） 灯有寿命，要节约使用。（4） 启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。 启动后要预热 半小时。（5） 不要用眼睛直视灯。第18页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一2 样品池在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。（1）设置空白对照 。 （2）清洗问题，关键是即时冲洗。自来水冲洗SDS浸泡双蒸水冲洗浓硝酸处理双蒸水冲洗第19页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（二）荧光分光光度术中的参量exMaximum excitation wavelength em, max Maximum emiss

10、ion wavelength第20页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一激发光谱与发射光谱的关系i）波长比较 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致）ii）形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激后可到达不同能层的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。 换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。第21页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一iii）镜像对称 通常荧光光谱与吸收

11、光谱呈镜像对称关系。第22页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一解释1：能层结构相似性 荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。 吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。 由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。S1S0第23页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一解释2：位能曲线（Frank-Condon原理） 由于电子吸收跃迁速率极快（10-15s），此时核的相对位置可视为不变（核较重）。当两

12、个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。第24页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一A 荧光强度的定义：在一定激发波长(ex)作用下，发射的 荧光强弱。 F=Ia Ia=I0-I，I=I010-cL F = I0(1-10-cL ) 当C很低时F= I0cL ， 当C较大时F=I0 B =发射光子数/吸收光子数 2 荧光强度（fluorescence intensity, F, I ）与 量子产率（quantum yield, ）（二）荧光分光光度术中的参量第25页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光强度与浓度的关

13、系第26页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光偏振( fluorescence polarization)（二）荧光分光光度术中的参量自然光 部分偏振光 偏振光第27页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一I/-II/+IP=I/-II/+2IA=荧光偏振度Fluorescence polarization -p 荧光各向异性Fluorescence anisotropy - A第28页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一(1) 荧光偏振度的物理意义：A ：I/=I ，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取 向随机。（稀溶液）B：I/

14、或I为0 ，P=1 偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。C： I/I 0 ，0P1，生物大分子的荧光属于这种情况。第29页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一(2) 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响 A .温度的影响：溶液粘度 A：温度的影响 温度升高，P降低 B：溶液粘度 粘度升高，P升高C：分子的运动转动旋转弛豫时间rotational relaxation time 第30页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（二）荧光分光光度术中的参量4 荧光寿命 （Fluorescence liftime -） 荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/e所需

15、要的时间I=I0e-kt , =1/k 分子所处的环境有无淬灭有无能量转移有无分子间相互作用影响因素第31页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光寿命 除去激发光源后荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/ e所需要的时间。荧光 分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态（总自旋S=0,两个电子自旋相反，M=2S+1=0)最低振动能级回到基态任一振动能级时发射的光。4.1、荧光寿命第32页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 基于荧光寿命测量的荧光猝灭技术研究 猝灭剂与荧光标记物靠近的难易，研究标记物所处的微环境。时间分辨荧光光谱用来研

16、究激发态分子间相互作用，非辐射能量转移及时间分辨荧光各向异性主要荧光技术都离不开荧光寿命的测定。第33页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一1821，首次记录了荧光现象。1852，Stokes ，窐宁 、叶绿素，荧光是吸收后的发射光不是漫反射，猝灭现象。1867，Goppelsorder 首次荧光分析，铝-桑色素配合物进行铝的测定。19世纪末合成了一些有机染料，认识了荧光素、署红、多环芳烃600多种荧光物质。4.2、荧光寿命的发展历史第34页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一光速的测定及磷光计的发明，测定时间间隔0.0001s, 不能测定荧光。Kerr

17、 cell(克尔盒）和荧光寿命的测定。时间间隔0.00000001s(荧光寿命通常在纳秒级）。电子快门，前后放置偏振滤光镜，不加电压光线不通过，加电压后，分子有序允许光线通过。第35页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一第36页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一第37页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一4.3、荧光寿命测定方法1、时域法 用超短光脉冲(1-2ns)激发样品，测量样品在激发后荧光强度的衰减将规律，根据样品中各点的荧光强度衰减曲线来拟合分析荧光寿命值。2、频域法 用强度按正弦规律调制的激光激发样品，荧光强度按正弦调制，

18、两者频率相同，通过激光相对与荧光的相位差及解调系数来测定荧光寿命。3、时间分辨荧光各向异性。4、多光子激发。第38页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一5 荧光探针具有环状共轭双键即电子系统量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein (4) 与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价 结合第39页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光成像在医学上有很长的发展历史 。只有两种荧光基团被美国食品和药物管理局（FDA）认可，应用于

19、医学领域，分别是吲哚花青绿（IGG）和荧光素。荧光素已经有三十年的应用史，最初是应用于眼科；吲哚花青绿已经被用作眼科剂，并且作为肝功能剂有五十年的历史。 荧光探针在医学成像中的发 展历史第40页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一第三种荧光基团是罗丹明B，1966年得到认可并应用，但是在1987年因为和小鼠癌症有关而被禁止使用 。这两种药物主要用于获得视网膜血管造影。要求相当高剂量。（荧光素和吲哚花青绿的单人剂量分别为500和40毫克）虽然会发生过敏反应之类的副作用，但是特殊的器官毒性还没有被报道。第41页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光探针用于

20、医学成像的一般要求用于医学成像的分子探针有以下要求 ： 波长 亮度 生物和光稳定性 药物动力学第42页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一5.1 波长荧光基团需要激发光才可以发射光。紫外区的激发光能引起组织损伤，近红外区的激发光能给组织加热。蓝色和绿色激发光组织穿透性很差，使他们只能在表面组织或小的动物组织中成像 。 黄光或红光区（大约600nm），这些波长会有过量的荧光出现，因为有自动生成的内源性荧光。 第43页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一5.1 波长较低波长的激发光不能穿透组织产生散射光，所以即使散射波长在理论成像上是合适的，激发光也不能穿透

21、较深组织。 激发光和散射光理想波长在650-900nm。在这个波程内，吸收和自发荧光都是最小的，所以光穿透是最大的 。第44页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一5.2 亮度选择荧光基团需考虑的第二个因素是亮度 。越明亮的试剂，穿透能力越强。但是，亮度的增加通常会导致探针尺寸的增长。例如，用于基因编码的绿色荧光蛋白基团在深层的可视化活体成像中是非常明亮的，但它非常大，有25-50kDa，难于连接，使得它对许多应用是不切实际的。量子点也是非常明亮的，但是由于较大的尺寸而难于接上目标。其组成部分，例如硒和镉，都是重金属，其潜在的毒性问题必须考虑。第45页，共90页，2022年，

22、5月20日，19点42分，星期一5.3 稳定性荧光基团的稳定性是又一个需要考虑的因素 。虽然这些分子在体外通常是稳定的，但是在体内的稳定性，尤其是在细胞内的内化作用之后，稳定性通常是值得商榷的。一旦被内化到溶酶体内，大部分的荧光基团，除了罗丹明，包括荧光素，氟硼荧（BODIPY）和喹啉蓝衍生物，都会在数天内失去荧光。在罗丹明衍生物的案例中，荧光能维持至少一个星期的时间。此外，大多数有机荧光基团被光漂白之后它们的荧光能力会受到威胁。因此，当连续性观察是必须之时，有机荧光探针必须反复被注射。而且在体外成功可能无法预知在体内成功，因为试剂的生物半衰期可能太快，起不到作用。 第46页，共90页，202

23、2年，5月20日，19点42分，星期一5.3 稳定性从运动的角度来看，一定水平的降解是合理的，因为这样产品就能够排泄出来。例如量子点，代谢起来非常慢，用于临床必须完全的排泄出来。稳定性不仅取决于荧光基团，而且也取决于其偶合物。一旦荧光基团通过一个连接器分子偶合到靶向配体，其稳定性可能会因为由分解代谢而产生的药物动力学改变而受到损害。例如，一个荧光基团自身可能被迅速的排泄出去，但是当将其与一个大的载体分子连接时，将会在体内存在更长的时间，从而产生不可预见的可能对荧光有害的作用。第47页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一5.4 药物动力学大部分小分子荧光基团都能改变与之共轭的

24、靶标基团的药物代谢动力学，如多肽和蛋白质，尤其是当一个以上的荧光基团连接到目标共轭配体上时。例如，当几个荧光基团，如罗丹明X和Cy5.5被连接到一个单一的蛋白质分子时，荧光基团能够彻底改变靶向探针的药物动力学。当这些小荧光连接到糖或氨基酸时，这些荧光基团主导了药物与人体之间的作用。量子点（Qdots）或其它的荧光纳米微粒甚至比抗体更大，因此，与荧光颗粒如Qdots相连的特定目标分子的药物动力学性质与最终形式的探针差别很大。 第48页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一48（5）荧光探针的应用分类 测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂

25、，阴离子膜探针，阳离子膜探针， 其它非极性和双亲性膜探针。细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 Ca2， Mg2， Zn2 ，Na， K， Cl等离子荧光探针 pH荧光探针: 近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物 活性氧和一氧化氮探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针pH 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂 细胞骨架蛋白荧光探针 第49页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一四 荧光生色团的结构特点1 天然荧光生色团的结构特点（1）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有

26、利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。 第50页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（2）分子的几何排布： 具有刚性平面结构 荧光素酚酞四 荧光生色团的结构特点第51页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（4）取代基的位置： 邻位、对位荧光增强，间位荧光减弱（-CN基例 外）(5)环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光四 荧光生色团的结构特点（3）取代基的类型： （1）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 （2）减弱荧光的基团：

27、得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I （3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH3第52页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一2 蛋白质和核酸中的荧光生色团Tryptophan(W, Trp)Phenylalanine(F, Phe)Tyrosine(Y, Tyr)四 荧光生色团的结构特点第53页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一生色团条件exnmmax10-3emnmFFns敏感度maxF 10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741

28、.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeas t-RNAPhe3201.34600.076.30.91亚硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe ex:460nm, em:570nmex:365nm, em:515nm四 荧光生色团的结构特点第54页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 五 影响荧光测量的因素1 光化分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂荧光减弱2 淬灭(quenching)温度淬灭： 温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C

29、的范围内，温度系数大约为1.5。浓度淬灭： 21 内滤光效应（inner filter effect)(3)杂质淬灭：3O2 1O2第55页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一动态猝灭 荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子之间所发生的导致荧光强度变化或相关的激发峰位变化或荧光峰位变化的物理或化学作用过程。 荧光的猝灭可以分为动态猝灭和静态猝灭两种。一般情况下,动态和静态猝灭可根据不同温度下的猝灭常数来判断。动态猝灭又称碰撞猝灭,它是荧光体之间相互碰撞导致的猝灭,而静态猝灭是由于生成了复合物而引起的荧光猝灭。5.1.荧光猝灭理论第56页，共90页，2022年，5月20日，19点

30、42分，星期一 动态的碰撞猝灭理论可以用Stern Volmer方程来描述: F0,F 分别是不存在和存在猝灭体时的荧光强度 kq 是生物大分子的猝灭常数 0 是不存在猝灭时荧光体的荧光寿命 Q 是猝灭体的浓度 kq0=Ksv称为Stern-Volmer猝灭常数。根据方程,以猝灭据F0/F和猝灭体浓度作图应得到一条直线,其中斜率为Stern-Volmer猝灭常数, Ksv 随着温度的升高而升高。第57页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 静态猝灭是荧光体和猝灭体之间形成了不产生荧光的复合物而引起的。静态猝灭可以用Line weave-Burk方程来描述: 式中K是荧光体和

31、猝灭体之间的结合常数，可以通过方程得到的直线的斜率和截距求得。静态猝灭第58页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 由于静态猝灭是由荧光体和猝灭体形成了复合物而引起的,温度升高会降低复合物的稳定性,因此,静态猝灭的猝灭常数会随着温度的升高而降低;动态猝灭是由于荧光体和猝灭体之间的碰撞引起的,所以,温度升高会增加它们之间的有效碰撞,导致猝灭速率加快,猝灭常数也增大。第59页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 激基缔合物(Excimer)是指两个同种分子或原子的聚集体在激发态时两分子或原子作用较强，产生新的能级，使发射光谱不同于单个物种,无精细结构,而在基

32、态时作用较弱或无作用。 5.2 激基缔合物第60页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一3 溶液pH的影响利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。指示剂颜色变化pH范围萘 酚无色变黄绿荧光素浅绿变绿丫啶橙浅黄绿变黄第61页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一4 溶液极性的影响荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。DPH水溶液中膜 中发射波长：440nm发射波长：430nm第62页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一5

33、溶剂和化学试剂(1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2) 溶剂要纯6 荧光污染(1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞(2) 去污剂(3) 微生物污染(4) 滤纸第63页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一六 荧光分光光度术的应用(一）.物质的检测 1 测量原理： 稀溶液， F= I0cL 2 结构特点：含有“芳香环”结构 3 灵敏度：10-710-8g/ml第64页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一检测物质激发波长nm发射波长nm维生素A345490维生素B2，pH7370565维生素B12， pH7275305维生素C49

34、05303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羟色胺，中性或弱酸性2953305羟色胺，盐酸295550，330第65页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一研究生物大分子构象 （二）蛋白质的荧光分析1 蛋白质的内源荧光第66页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一2 蛋白质的外源荧光第67页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（三）核酸的荧光分析嘌呤及衍生物室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。碱性介质中，鸟嘌呤有荧光嘧啶及衍生物游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低0.00153

35、核酸的荧光标记第68页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一Probes exemNoteEthidium Bromide545610非透膜，RNA,DNAPropidium Iodine530615PO-PRO-1 iodine435455Acridine Orange490590透膜，RNA,DNAPyronin Y545580Bisbenzimide345460透膜，DNA第69页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（四） 利用荧光技术检测分子间结合程度1 用荧光偏振变化检测结合程度当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变其荧光特

36、性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结合时的信息。结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。第70页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一用杀鼠灵滴定HSA Scatchard图r = L Ka (n - r) L = L0 LP = L0 rP0ex=320nm em=400nm2 用荧光强度变化检测结合程度第71页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一（五） 大分子内基团间或分子间距离的测定荧光共振能量转移( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)第72页，共90页，2022年，5月20日，

37、19点42分，星期一荧光共振能量转移的三个条件：供体和受体都能发光供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠供体和受体的距离必须小于100第73页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一Forster 公式E= R06/(R6+R06)R0: 临界距离，E：转移效率，R：基团间距离E= 1- IDA/ID IDA: 受体存在时的荧光强度，ID：受体不存在时的荧光强度 大分子内基团间或分子间距离的测定第74页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一第75页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 寡核苷酸用作分子探针和生物传感器(通过连接许多荧光团到

38、寡核苷酸链上) 1.杂交型探针： 靶标分子与探针 互补匹配。 2.适配子探针： （传感器） 三维空间生物识别 第76页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一荧光团猝灭剂凝血酶寡核苷酸发夹结构同理，若将猝灭剂改为另一种荧光团，利用FRET原理也可用于检测凝血酶的活性。寡核苷酸的适配子探针第77页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一 双重芘标记的DNA探针，芘部分被发夹结构牢牢的拴在一起，形成激态聚合体，在485nm发射荧光。当与RNA结合时，发夹结构被打开，芘分成两部分，荧光发射蓝移到378nm和397nm（单体）形成DNA-RNA的杂交体。加入RNase

39、H后，RNA链被分裂下来，DNA又恢复为原来的发夹结构，芘部分重新结合形成激态聚合体，发射波长为485nm，荧光增强。整个过程可用于检测RNase H的活性。第78页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一1 膜流动性 DPH ：P值小，流动性高 2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2 膜渗漏性 羧基荧光素( selfquenching) 3 膜电位的测量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+) KO+：细胞外浓度， KI+：细胞内浓度 荧光探剂：花菁（cyanine) K+载体：缬氨霉素： （六） 膜生物物理研究第79页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一4 膜融合机理的研究方法一 ：利用能量共振转移现象第80页，共90页，2022年，5月20日，19点42分，星期一II方法二：利用淬灭现象第8