分子生物学课章

1、分子生物学课章第1页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 转录(Transcription) 以DNA为模板合成RNA 的过程。第2页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一14.1 转录的特点 以DNA为模板酶促合成RNA RNA聚合酶以双链DNA中的一条链（或单链DNA）为模板，按照A与U（或T与A）、G与C配对的原则，将4种核糖核苷酸（NTP）以3,5-磷酸二酯键的方式聚合起来，催化合成与模板互补的RNA。 被转录成单个RNA分子的一段DNA序列，称为一个转录单位。一般由启动子（promoter）、结构基因（structural gene） 、终止子（

2、terminator）三部分组成。 355结 构 基 因pt3第3页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 DNA双链中只有一条链被转录成RNA 实验证明，双链DNA中只有一条链作为模板转录合成RNA。 负责转录合成RNA的DNA链叫模板链（template strand），另一条链叫编码链（coding strand）。模板链与编码链互补，模板链转录合成的RNA的碱基顺序与编码链的碱基顺序完全一致，只是其中的T被U取代而已。 转录的方向为53模板链编码链5553第4页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一14.2 原核生物基因的转录 原核生物基因的转录过程

3、已基本研究清楚，共包括模板的识别，转录起始、延伸、终止等4个步骤。第5页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一1.原核生物的RNA聚合酶 1) RNA聚合酶的结构 全酶（2）含2拷贝亚基，、和各一个。分子量大约500 000。 亚基的作用仍不清楚。 在大肠杆菌的RNA聚合酶中，因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与2，分离，后者称为核心酶。第6页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一细菌的RNA聚合酶全酶：2：500 kD和亚基 ：催化中心，构成核酸通道；亚基：核心酶组装所需；也与调节因子作用；亚基：启动子识别，具有启动子特异性。亚基？第7页，共44页，

4、2022年，5月20日，19点35分，星期一RNA聚合酶的核心酶结构（即从全酶中去掉亚基）第8页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一亚基基因分子量数目组分可能的功能rpoA40 0002核心酶酶的连接，装配rpoB155 0001核心酶与底物（核苷酸）结合rpoC160 0001核心酶与模板结合10 0001核心酶不详70rpoD70 0001因子与启动子结合，识别模板链E.coli RNA聚合酶的结构与功能 第9页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 2) 亚基 亚基在RNA合成的起始中具有关键作用。 在生物进化过程中，形成了不同的亚基。不同的亚基可以

5、帮助RNA聚合酶识别不同的启动子序列。第10页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一细胞中不同状态RNA聚合酶的数量每个E.coli细胞中含约7000个RNA 聚合酶；核心酶主要以松散的闭合复合体为主；足量的亚基使三分之一的聚合酶以全酶形式存在，主要是在非特异位点的松散复合体和启动子处的紧密（开放）复合体；约2500个核心酶正在进行转录。第11页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一核心酶与DNA双链的作用比较松散，结合半寿期约1 hr。核心酶不区分启动子和其他序列。亚基加入后，全酶与松散结合位点的结合力下降，半寿期1 s；但与启动子结合可增强1000倍，半

6、寿期达几个小时。全酶与启动子结合常数基本反映了启动子的强度。亚基与核心酶的解离-结合对RNA聚合酶功能的影响第12页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 2. 转录过程1) 启动子 （promoter） 启动子RNA聚合酶识别、结合、并启动转录的DNA序列。 两组序列： Pribnow框（ Pribnow box）又叫10区，序列为： TATAAT Sexfama框（Sexfama box）又叫35区，序列为：TTGACA 第13页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一第14页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一细菌启动子特征：1、起点

7、通常是一个嘌呤；2、起点上游10 bp处，有一约6 bp的保守区域，称为-10 区（也叫Pribnow Box），共有序列为： T80 A95 T45 A60 A50 T96 ；3、起点上游35 bp处，有一约 6 bp的保守区，称为-35 区，共有序列为： T82 T84 G78 A65 C54 A45；4、90%的启动子中，-10与-35区的距离在16-18bp之间；两个保守区之间的序列并不重要，但距离很关键。第15页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一第16页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一因子与启动子的结合第17页，共44页，2022年，5月

8、20日，19点35分，星期一70的2.4区的氨基酸与启动子-10区非模板链特异碱基的结合第18页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 RNA聚合酶对启动子的识别可能有三种方式:随机扩散随机行走定向取代2) 模板的识别第19页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一全酶-启动子形成闭合二重复合体；闭合复合体转变为开放复合体；整合进最初两个核苷酸，形成一个磷酸二酯键，形成三重复合体；在酶不需要移动时，即可加入9个核苷酸，但在加入核苷酸过程中，随时可能释放RNA；起始成功后，释放出亚基。3) 转录的起始第20页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期

9、一RNA聚合酶结合在DNA上时，其长度会发生变化尺蠖模型第21页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一4) 转录的延伸 第22页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一转录过程中的模板识别、起始与延伸第23页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一终止子（terminator）：终止RNA合成反应所需的DNA序列；在转录结束的位点，提供终止信号。RNA合成的终止实际依赖于已转录的RNA序列。终止发生有两种方式。5) 转录的终止不依赖于因子的终止子依赖因子的终止第24页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一不依赖于因子的终止子（

10、intrinsic terminators ） 合成的RNA尾部的序列特征：(1) 二重对称的序列形成发卡结构；在发卡结构的茎基部富含G-C对；发卡结构可减缓或暂停合成；(2) 尾部有约6个连续的U；连续的A-U对使杂交链更容易分离。第25页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一第26页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一依赖因子的终止因子：六聚体，每个亚基46kD,也称终止因子；具依赖RNA的ATP酶活性；在E.coli中可结合于自由RNA链，并沿RNA链移动；序列特征：有一富含C而少G的序列终止子序列:第27页，共44页，2022年，5月20日，19点

11、35分，星期一先结合于RNA链上；沿 RNA链移动；RNA聚合酶在终止子处暂停；因子追上聚合酶并使之解离，并拆分RNA-DNA杂交链。第28页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一3. 原核生物RNA转录后的加工1) mRNA的加工 原核生物转录生成的mRNA基本上不经加工即可进行蛋白质的生物合成（翻译）。事实上许多原核生物的mRNA是在转录尚未完成之前就已开始翻译了。也就是说，转录与翻译是偶联在一起的。许多转录生成的RNA需经加工后才能成为有功能的RNA分子。加工方式:剪接(剪切) 、加头加尾、修饰第29页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 rRNA的

12、加工过程是以核糖体颗粒的形式进行的，即rRNA前体合成后先与蛋白质结合，形成新生核糖体颗粒，而后再经过一系列的加工过程，生成有功能的核糖体。 在原核生物中，rRNA包括三种，即16S，23S和5S rRNA。在大肠杆菌中，这三种rRNA的基因形成一个转录单位，其中还包含一个或多个tRNA基因，它们之间由间隔区分开。2) rRNA的加工第30页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一3) tRNA的加工 a. 剪切 b.在3端形成-CCA c.tRNA中含有大量修饰成分，还要通过各种不同的修饰酶进行修饰，才能成为成熟的tRNA分子。第31页，共44页，2022年，5月20日，19

13、点35分，星期一14.3 真核生物RNA的转录过程 (1) 真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶I：转录 rRNA；RNA聚合酶II：转录 mRNA前体(HnRNA)； SnRNA ；RNA聚合酶III：转录 tRNA和5S rRNA 。 起始需要辅助因子，但随后不需要。与原核生物相反，真核生物中由辅助因子识别启动子（？）第32页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一种类在细胞中的位置对-鹅膏蕈碱的敏感性合成RNA的种类RNA聚合酶 I核仁不敏感10-3mol/L5.8S、18S、28S rRNARNA聚合酶核质最敏感10-910-8mol/LmRNA、snRNARNA聚合酶核

14、质介于酶I和酶II，10-510-4mol/LtRNA、5S rRNA真核生物RNA聚合酶的特性第33页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一(2) 真核生物的启动子1）RNA聚合酶I只有一种启动子。含两个结合位点：核心启动子（core promoter）:-45+20,上游控制元件（upstream control element，UCE）:-180-107第34页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一帽子位点：即转录起始位点，碱基大多为A。TATA box：位于RNA聚合酶II转录起点上游约- 25 bp处的保守的7碱基序列，绝大多数情况下全部是A-T碱

15、基对，只有少数含有G-C。CAAT box：起点上游-75附近的小段保守序列。增强子（enhancer）：可增强启动子效率的序列，可位于启动子上游或下游；可远距离作用。2）RNA聚合酶II启动子TATA boxT82A97T93A85 A83 CAAT boxGG CAATCT第35页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一RNA聚合酶在转录时需要一些辅助蛋白质因子即转录因子（transcription factor,TF），这些因子和酶一起构成一个转录结构，识别特定的启动子序列。激活型结构域柔性连接DNA-结合结构域第36页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星

16、期一 3）RNA聚合酶III的启动子转录5S RNA、tRNA基因；5S RNA和tRNA的启动子在转录起点的下游。第37页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一(3)真核生物RNA转录后的加工1) mRNA“首、尾”的修饰5-末端三种 “帽”的结构3-末端多聚（A）尾（ poly A） 帽子结构第38页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一2)真核mRNA的剪接 第39页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一3)真核rRNA转录后的加工 在真核细胞中有4种rRNA，即28S、18S、5.8S和5S rRNA。rRNA是在核仁中合成的。前三

17、者的基因组成一个转录单位，在转录过程中先形成一个45S前体。然后，在核内经过一系列的加工过程，再转移到细胞质中。而5S rRNA与tRNA一起由RNA聚合酶转录，处在另一个转录单位中。第40页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一4)真核tRNA转录后的加工 切除tRNA前体两端多余的序列：这一过程是在特异性酶的催化下完成的； 末端的添加：即在3末端添加-CCA序列，此一步由tRNA核苷酰转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）催化。 修饰：tRNA修饰碱基很多，主要为甲基化修饰，占被修饰碱基的一半以上。还有其他一些方式的修饰，如碱基置换或转换等。第

18、41页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一14.4 催化活性RNA核酶及其功能四膜虫rRNA前体的自我剪接 第42页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一 L19 RNA以高度特异的方式催化寡聚核糖核苷酸的裂解和联结反应。五胞核苷酸（C5）被L19 RNA转变为更长一些和更短一些的寡聚体。具体地说，C5被降解为C4和C3。与此同时，又能生成C6和更长一些的聚合物。可见，L19 RNA既是一个核糖核酸酶，又是下一个RNA聚合酶。 现在把RNA性质的酶称为核酶（ribozyme）。除了L19 RNA外还发现了一些其他的核酶。看来核酶更适合于识别和催化单链的核酸分子，因为核酶和这类底物使用的是共同的语言碱基配对。第43页，共44页，2022年，5月20日，19点35分，星期一核酶发现的生物学意义: 核酶的发现使人们对于生命的起源有了新的认识：生命的最初形式大概是RNA，最初的生命界可能是个RNA王国。因为RNA既可作为模板而复制繁殖，