DB12-T839-2018茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法

1、ICS 65. 020. 20B 04DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T 8392018茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法Method of identifying seed purity of eggplant by using SSR-based marker2018- 11 -07 发布2018-12-01 实施天津市市场和质量监督管理委员会 发布DB12/T 8392018 I本标准按照GB/T 1. 12009给岀的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提岀并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科 学院农产品质量安全研

2、究所。本标准主要起草人：兰青阔、王利英、赵新、王成、兰璞、乔军、刘靖、陈锐、关海涛、张耀中、 焦贺敏。DB12/T 8392018 茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法1范围本标准规定了茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。 本标准适用于茄子单交种的纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标 准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 3543. 2农作物种子检验规程抨样GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本

3、文件。3. 1种子纯度 seed purity种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子 粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。3. 2聚合酶链式反应 po I ymerase cha i n react i on （PGR）一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。3. 3简单重复序列 simple sequence repeat （SSR）由几个核昔酸（16个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp （一般为100200）的串联 重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3. 4分子

4、标记 mo I ecu I ar marker以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。4原理SSR分布于茄子整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术 将多态的SSR扩增岀来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行茄子种子纯度鉴定。5仪器设备及试剂5. 1仪器设备PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪(3000 V, 400 mA, 400 W)；万分之一电子天平； 微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅； pH计等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)；三羟甲基氨基甲烷(Tr

5、is)；盐酸(HCL 36%)；十二烷基硫酸 钠(SDS)；氯化钠(NaCl)；氢氧化钠(NaOH)；硼酸；去离子甲酰胺；漠酚蓝；二甲苯青FF；甲叉 双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铉; 冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液(37%) ； Taq DNA聚合酶(含Mg*的10XPCR缓冲液)；四种脱氧核糖核昔酸 (dNTPs) ； SSR引物；琼脂糖；Gold View染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馅 水或符合GB/T 6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.3溶液配制相关溶液配制方法见附录A。

6、6方法步骤6. 1取样检测样品的分样和保存，应符合GB/T 3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料 各10份。6. 2单粒种子的DNA提取6. 2. 1样品预处理在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面 覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h 35C光照培养，8h 28C暗培养，待种子长岀子叶 后备用。DNA 提取取单株幼苗子叶，放入1.5 mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将DNA提取液预热 到65 C,每管放入400)1L混合样品，将离心管置于65 C金属浴或水浴锅中，保温30 min后取

7、下，向 离心管中加入400 gL 24:1氯仿-异戊醇(V:V),振荡混匀。10 000 g离心10 min。将上清液200叽转 入另一支1. 5 mL离心管，加入400 |iL -20 C预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000 g离心1 min,弃上清液， 加入500叽乙醇乙酸铉溶液，6000 g离心5 min收集沉淀。加入100 gL TE (pH8.0)溶液溶解DNA。DNA的浓度和质量将DNA适当稀释或浓缩，使其0D河值在0.10.8的区间内，测定并记录其在260 nm和280 nm的吸光 度。以1个0D滅值相当于50 mg/L DNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测

8、DNA完整性。 DNA溶液的0D260/0D280值应在1. 7-2. 0之间，或质量能复合检测要求。6.3分子标记筛选DB12/T 8392018 用15对核心引物进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA,筛选带型清晰，双亲间差异大，互 补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。6. 4 PCR扩增6. 4. 1反应体系总体积10卩L,包括5卩L超纯水、1卩L含Mg*的10XPCR缓冲液、0. 8卩L dNTPs (2. 5mmol/L)、 0. 6 p LSSR引物(10 p mol/L)、1 p L Taq DNA聚合酶(2. 5U/p L)、1 卩 LDNA (3050 ng/

9、p L), 混匀。6. 4.2反应程序94 C预变性5 min； 94 C变性 1 min, 55 C退火30 s, 72 C延伸 1 min,循环35次；72 C延伸 10 min； -20 C保存备用。6.5变性聚丙烯酰氨凝胶电泳按照附录C规定的方法，进行4. 5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。7 纯度计算以筛选岀来的SSR分子标记为引物扩增送检样品的DNA,通过带型统计，用具有本品种特异带型的种 子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：纯度 =具有本品种特异带型的种子粒数检测样品种子粒数X 附录A(规范性附录)溶液配制A. 1 DNA提取液含有200 mmol

10、/L Tris-HCl (pH 8. 0) , 250 mmol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA, 0. 5%SDS,经高压蒸 汽灭菌后使用。A. 2引物稀释按照引物合成单的说明先配制100 p mol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2. 5 mmol/L的使用液。A. 3 6 X变性上样缓冲液去离子甲酰胺49 mL, 0. 5 mol/L的EDTA溶液(pH 8. 0) ImL,漠酚蓝0. 125 g,二甲苯青0. 125 g。A. 4 10X电泳缓冲液Tris 108g,硼酸55 g, 0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0)溶液37 mL,定容至

11、1000 mLA. 5 40%丙烯胺胶丙烯酰胺19。g,甲叉双丙烯酰胺10 g,定容至50。mLA. 6 A. 6 4. 5%丙烯胺胶尿素450 g, 10X电泳缓冲液100 mL, 40%丙烯酰胺胶112. 5 mL,定容至1000 mLA. 7 1 %亲和硅烷20卩L亲和硅烷，20卩L冰醋酸，加无水乙醇至2 mL现用现配。A. 8 2%剥离硅烷1 mL剥曷硅烷，49 mL三氯甲烷。A.9 10%过硫酸镀0. 1 g过硫酸铉溶于1 mL超纯水中。现用现配。A. 10固定液200 mL冰醋酸，定容至2000 mLA. 11染色液4 g硝酸银，定容至2000 mLA. 12显影液2000 mL蒸

12、馅水中加入40 g氢氧化钠和10 mL甲醛。附录B（规范性附录）15对核心引物15对核心引物见表B. 1表B. 1 15对核心引物表序号引物引物序列（53，）退火温度笆1QZ-1F: GGATCAACTGAAGAGCTGGTGGTT R: CAGAGCTTCAATGTTCCATTTCACA552QZ-2F: ACGTCTCATCCGAAATATAATGCCGC R: GTTTGATAAGAAGGGCAAGCTCAGTCC553QZ-3F: ACAAGACGAAAGTGTGCAGACCAG R: GTTTGAAAGTGAAGAGTCCGTGCAGT554QZ-4F: ATGTTCTTCCCTTT

13、TTCCCCTTTTR: GTTTCCAAGAAAGAAGAAAACCCCACA555QZ-5F: ATCAAGATGAACAAGACTAAGGAGTGC R: GTTTCTTCAACCTGTCTTTAGCCCA556QZ-6F: ATCATTGCCGIATCAGGTTCACTCR: GTTTGGGAAAGTTGAGAATTTCTTGGGG557QZ-7F: ACAGGCATCACAAAGCATTATCAG R: GTTTCAGAGTGAGCCTCTGCTCC558QZ-8F: ACAACATTTCTAAGGGCCTTCACG R: GTTTGGGCATATTTGGCACTTGTTGAAT55

14、9QZ-9F: ATTTACTATGCTACTTCACACCCACC R: GTTTACTGATCGCAGGAAAAGGGAAAG5510QZ-10F: ATGTGTGAACTCAAATGGAAGGGA R: GTTTCGAATTGCTTTTTGGTGCATGTAG5511QZ-11F: ATTGGTGAACGATGATCCTGAATGR: GTTTAGAGAATGGGATGAGATTGCTTCG5512QZ-12F: ATTGACGGTGGAAAAGGAGTTGGT R: GTTTGGCGGCTTGATGATTTAAGTTTTG5513QZ-13F: ATCAAATGGGAGAAAATACT

15、GCATCR: GTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC5514QZ-14F: ACCTTACGCAATTTACACTTCCCC R: GTTTCAATGGCGTCACCTCTCTCTCT5515QZ-15F: AGTGCATTTCTCAAATCAAAAGGG R: GTTTCAATTTCACAGGCTCCTGCATTA557DB12/T 8392018附录C（规范性附录）制胶过程C. 1凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作 过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好，用水平仪调平。取4. 5%丙烯酰胺 胶80 mL,加入TEMED 80卩L和10%过硫酸铉400卩L,迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌 胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1 h以上。6. 2预电泳待胶凝固后，拔岀梳子，将电泳槽组装好，80 W恒功率下预电泳15 min20 min。C. 3变性在20卩L PCR产物中加入4卩L 6X变性上样缓冲液，混匀后，在PCR