蛋白样本制备与Western Blot

1、蛋白样本制备与Western Blot第1页主要内容蛋白样本制备目标1蛋白样本制备总体标准和策略2案例分析细胞总蛋白提取3成功 Western Blot6蛋白提取产品选择指南4蛋白定量方法选择5第2页一 蛋白样本制备成功蛋白分析基础蛋白样本activity assaysprotein microarraysSDS/IEFimmunoblottingmass spectrometry2-DEEMSAELISA蛋白样本制备目标: 后续应用第3页二 蛋白样本制备标准蛋白样本制备标准方法应具备标准化，含有重现性 、可靠性、简便性；尽可能抽提完全；应使全部蛋白全部处于溶解状态预防发生蛋白降解、聚集、沉淀

2、、变性预防在抽提过程中发生化学修饰如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中核酸和一些干扰蛋白。第4页二 蛋白样本制备策略制备蛋白目标活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等试验材料 细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后剩下蛋白样本等目标蛋白结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸化等修饰方法选择 1 自行配制抽提试剂,依据文件方法或经验提取 2 购置商品化试剂盒,按其说明书方法提取第5页三 案例分析- 细胞中总蛋白制备高速离心搜集上清即得全蛋白样本细胞加入裂解液冰上放置1

3、0-15分钟蛋白定量和SDS检测裂解样品离心搜集定量检测第6页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点表面活性剂缓冲液蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：H2O、NaCl、等还原剂RIPA Buffer第7页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点 缓冲液Tris-HCl（pH7.5),提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。第8页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点表面活性剂溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（尤其是膜蛋白）分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。第9页各类表面活性剂特点 1

4、 阴离子型: SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等Company Logo第10页选取表面活性剂考虑原因参考文件汇报保持生物活性时使用表面活性剂选取表面活性剂考虑原因工作条件下表面活性剂溶解性使用分子生物学级表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等依据样本下游应用来选择表面活性剂种类考虑表面活性剂去除方法表面活性剂纯度影响提取蛋白质量保护蛋白活性时,不但考虑表面活性剂种类还有浓度尽可能使用毒性较低表面活性剂因不明原因一些蛋白适用专门表面活

5、性剂进行分离使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一个表面活性剂既能溶解蛋白又适合用于蛋白分析,常先用一个表面活性剂将蛋白溶解,而另一个表面活性剂取代进行蛋白后续分析第11页去除未结合表面活性剂1疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2透析法 Dialysis3凝胶层析法 Gel Chromatography4离子交换层析Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性剂疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除. 第12页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性，预防蛋白被水解，

6、使用前暂时加入第13页蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒第14页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶活化，预防蛋白样本脱磷酸化，使用前暂时加入。第15页磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包含非特异性磷酸酶（比如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（比如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（比如：PTP）。常规抑制剂主要包含： 试剂名称抑制作用氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸 第16页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点还原剂预防蛋白质发生氧化，保护二硫键

7、。DTT、 巯基乙醇等。.第17页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点其它水；溶剂NaCl：第18页全蛋白抽提时注意事项能够适量加入甘油,稳定蛋白注意事项能够适量加入Benzonase /DNase I等核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取粘度.抑制蛋白酶及磷酸酶使用Detergent种类 纯度 浓度 干扰 去除等原因Temperature 试剂和器皿冰上预冷,低温4操作细胞或组织样本量裂解液用量第19页细胞裂解液-RIPA Buffer配方分析及技术关键点第20页四 蛋白样本制备产品选择指南第21页核蛋白样本制备抽提原理低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;离心分离出

8、胞核;高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子) 试验注意事项试剂和器皿冰上预冷裂解液用量细胞总量抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂第22页膜蛋白样本制备第23页膜蛋白抽提方法及原理方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提 产物细胞膜蛋白细胞器质膜蛋白注意事项根椐膜蛋白种类和后续研究目标不一样,选择不一样产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.样本量第24页膜蛋白直接提取第25页蛋白分级提取 按蛋白溶解度不一样进行分级抽提,降低样品复杂性并富集低丰度蛋白质第一步：

9、用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)；第三步：用含复合表面活性剂蛋白溶解液，最终抽提前两次抽提后不能溶解膜蛋白约占整个样品11%（W/W）。第26页亚细胞分级抽提用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成份，再用适当蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不但大大降低样品复杂性，而且可对分离蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白亚细胞策略用不一样提取液逐层溶解第27页四种亚细胞组分分离提取结果第28页线粒体蛋白样本制备首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体,胞质,胞核.再用线粒

10、体抽提Buffer溶解线粒体蛋白.第29页其它蛋白抽提产品高丰度蛋白去除试剂盒信号蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒第30页五 蛋白定量产品选择指南第31页BCA法蛋白定量 BCA（bicinchoninic acid）是理想蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不一样种类蛋白质检测变异系数非常小而倍备受专业人士青睐。该方法原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中化学物质影响。在组织细胞裂

11、解试验中，低浓度去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。试验中，若发觉样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。 第32页Bradford法蛋白定量 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料最大吸收峰位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一个试剂。完成一个样品测定，只需要5分钟左右。因为染料与蛋

12、白质结合过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色能够在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色稳定性最好。因为各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸含量不一样，所以Bradford法用于不一样蛋白质测定时有较大偏差。去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法测定。 第33页Lowery法蛋白定量 Lowry法蛋白质测定法是最灵敏方法之一。过去此法是应用最广泛一个方法，在碱性条件下，蛋白质中肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰混合物）。在一定条件下，兰色深度与蛋白量成正比。这个测定法优点是灵

13、敏度高，缺点是费时间较长，要准确控制操作时间，标准曲线也不是严格直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。第34页六 成功Western BlotDiagram经过电泳区分不一样组分，并转移至固相支持物，经过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质Western印迹技术结合了凝胶电泳高分辨率和固相免疫测定特异敏感等各种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小靶蛋白 原理第35页六 成功Western Blot二抗孵育蛋白提取与定量一抗孵育封闭转膜SDS-聚丙烯酰胺电泳蛋白变性显影第36页蛋白变性Tris-cl(PH 6.8) SDS Glycerol Bromphe

14、nd-blue -巯基乙醇 DTT高温变性,形成蛋白质-SDS胶束急速冷却，预防复性加入Sample buffer沸水浴15min冰浴30min第37页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳产物：三维网状结构凝胶加速剂催化剂单体交联剂缓冲液Tris-Cl四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（Acr）过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（Bis）第38页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中各种成份作用 十二烷基硫酸钠(SDS) SDS是阴离子型表面活性剂，它能按一定百分比与蛋白质分子结合成带负电荷复合物，再与PAGE技术结合，则谱带差异愈加显著、清楚，并可测定蛋白质分子量。甘氨酸 样品和浓缩胶中氯离子形成移动界

15、面先导边界,而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡区域, 它推进样品中蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。第39页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液试验中各种成份作用蛋白上样缓冲液(SDSloadingbuffer)是一个以溴酚蓝为染料，5倍浓缩SDS凝胶电泳上样缓冲液,用于常规SDS蛋白电泳样品上样。 上样缓冲液（含一定量DTT或巯基乙醇）中巯基可使蛋白分子链内二硫键和链间二硫键断裂，使经过二硫键连接各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带。其作用增加样品密度以确保蛋白质沉入加样孔内，普通上样缓冲液中加入一定浓度甘油或蔗糖，这么能够增加样品比重。上样缓冲

16、液中甘油非常主要，起增加粘度作用，这能够阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳行进过程，普通加入泳动速率较快溴酚蓝指示电泳前沿 。第40页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中各种成份作用转移缓冲液中都含有适量甲醇，普通用甲醇浓度是10%-20%，低浓度5%-10%是能够提升大分子转膜效率，而高浓度30-40%时能够提升小分子转膜效率。甲醇能够降低电导，预防溶液过热，其实乙醇也能够。对于分子量较小蛋白质，甲醇能促进它们固定在固相纸膜上，但对于大分子量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，在转移缓冲液中是不宜加入甲醇。因甲醇使凝胶孔径变小，不利于分子量较大蛋白质从凝胶中转移出。因为甲醇能将结合在

17、碱性蛋白质上面SDS解离出来，而使其带正电或呈电中性，蛋白质也就更难从凝胶中转移出甲醇第41页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳过硫酸铵和TEMED试验中各种成份作用激活剂浓度适当是否不但能够决定凝胶聚合速度，也将影响凝胶质量。增加过硫酸铵或TEMED用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。第42页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tris-Cl高，依据蛋白大小电泳缓冲

18、液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。第43页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶浓缩胶作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶迁移作用而被浓缩至一个狭窄区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少许甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，所以一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超出蛋白，所以在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子快速移动，形成以稳定界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩

19、成一中间层。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。第44页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶 样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加紧，很快超出蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一外加电场下泳动，但因为蛋白质分子所带有效电荷不一样，使得各种蛋白质泳动速率不一样而形成一条条区带。第45页SDS-聚丙烯酰胺凝胶最正确分离范围不一样分子量范围蛋白质应选取不一样凝胶浓度。第46页聚丙烯酰胺分离胶配方第47页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶有效分离范围取决于用于灌胶聚丙烯酰胺浓度和交联度。在没有交联剂情况下聚合丙烯酰胺形成毫无价值粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶刚性

20、和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须经过小孔。这些小孔孔径随 “甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率增加而变小，比率靠近 1：20 时孔径到达最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 蛋白质。第48页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制分离胶 隔绝空气灌好后普通室温放置3040分钟第49页SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方第50页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制积层胶 插入梳子第51页SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方注意 氧气会与被激活单体自由基作用抑制聚合过程，所以需在加激活剂前对单体溶液脱气。假如省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需

21、更多激活剂，而且不能确保很好重复性，充分去除氧气能够用尽可能少激活剂得到最正确聚合效果。通常在很好真空度(125torr)脱气最少15 min 。 第52页SDS胶制备注意事项过硫酸铵普通现配现用，如连续试验可在4度放置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。配制过程中每加入一个试剂要充分混匀，预防胶出现浓度不均情况。要依据温度调整TEMED使用量。水封时候水要慢慢加入，太快会造成胶面不平。插梳子时候要用力均匀，一次成型。在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中杂质。第53页上样及电泳提前将样品沸水浴5分钟，114000rpm离心5分钟。依据自己设计上样。80V恒压跑浓缩胶。看溴酚蓝压缩

22、成一条线后把电压调为100V。当溴酚蓝跑至离胶下面还有0.40.6mm时停顿电泳。第54页SDS-聚丙烯酰胺凝胶缓冲液配方Tris （MW121.14）3.03g甘氨酸（MV75.07)14.4gSDS1g超纯水至1000ml电泳缓冲液转移缓冲液Tris （MW121.14）3.03g甘氨酸（MV75.07)14.4g甲醇200ml超纯水至1000ml第55页上样及电泳第56页上样及电泳第57页转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。第58页上样及电泳第59页转膜第60页转膜注意事项PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间气

23、泡。然后在转膜也中平衡20分钟。膜、胶、滤纸夹好后要将中间气泡全部赶出来，不然有气泡地方就会断路，蛋白无法转到膜上。转膜要在冰浴中进行，预防散热量太大造成转膜温度过高。依据蛋白分子量大小选择适合转膜条件。分子量（kd）转膜条件200同上，可在转膜液中加0.1SDS第61页膜封闭为防止膜与作为检测试剂特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提升，需对膜上潜在结合位点进行封闭处理,普通用5脱脂奶粉或者3BSA室温或37度封闭2小时。第62页转好蛋白膜ProteinProtein第63页封闭ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking A

24、gent第64页一抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary Antibody第65页二抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentEEPrimary AntibodySecondary Antibody第66页显影ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentEEPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme (E)sssssPPPP

25、 Substrate第67页显色方法 HRP酶促底物直接显色第68页显色方法化学发光SuperSignal West Pico化学发光底物SuperSignal West Femto超灵敏型底物SuperSignal West Femto增强型底物主要优点与ECL 系统相比减半价格、双倍信号适适用于HRP检测最灵敏化学发光底物延长信号连续时间使这种底物用于今天成像设备最为理想检测下限10-12g10-15g 10-14g信号连续时间6-8小时8小时二十四小时首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片提议一抗稀释度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-

26、1:50,000提议二抗稀释度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000产品保留期室温1年41年或室温6个月室温1年提议印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDF第69页成功要素质优量足蛋白样本科学对照正确抗体选择 保留和使用细致试验操作步步监测第70页科学对照蛋白Marker：预染或非预染各种分子量蛋白，用于标示电泳中蛋白大小和示踪阳性对照：目标蛋白或明确表示目标蛋白组织或细胞蛋白提取物，用于检验整个试验体系和过程正确性有效性/尤其是一抗质量和效率阴性对照：非目标蛋白或明确不表示目标蛋白组织或细胞蛋白提取物，用于检验抗体特异性二抗对照：不加一抗，用于检验二抗特异性内参对照：管家基因编码、很多组织和细胞中都稳定表示蛋白，用于检测整个WB试验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目标蛋白表示量标准对照空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜性质和封闭效果第71页蛋白Marker第72页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Company Logo标准蛋白分子量未知蛋白在一定凝胶浓度下，多肽链分子量对