蛋白定量与纯度分析

1、生物大分子活性物质定量与纯度分析 1 蛋白质定量测定 2粘多糖定量 3核酸含量测定 比色法测定 菲林试剂法 孚尔根染色法 紫外法测定 蒽酮法 定磷法 氮元素法测定 旋光法 二苯胺法 重量法测定 地衣酚法 紫外吸收第1页 2 蛋白质纯度分析 光谱法分析 层析法分析 电泳法分析 N末端法分析 生物活性法分析.第2页第一节 蛋白质定量分析1概况1.1蛋白含量 蛋白质定量分析通常是指测定蛋白质溶液中蛋白质量或蛋白质粉剂中蛋白质量。在进行蛋白质含量测定时，首先依据蛋白质物理化学性质特征和试验室现有条件来确定测定方法。蛋白质含量测定方法有很多，大致能够分为四类， 重量法 定氮法 比色法 氨基酸推算法等第3

2、页 采取测定方法不一样得到测定结果有差异。每-种方法有它独特优点，不过也有它不足。 在上述几个测定方法中测定数据最准确，最可靠属于定氮法和氨基酸推算法。这两种测定方法都是经过测定分子中氮元素或分子结构来确定蛋白质含量。所以，测得数据相对比较准确，不过它试验步骤比较多，操作比较繁琐。其它测定方法相对简单一些，是试验室惯用技术，灵敏度相对低一些。 测定蛋白质含量通常要采取两种以上方法，要依据蛋白质一些特征选择不一样方法进行测定。将各种方法测得结果综合考虑。第4页1.2 蛋白质浓度测定 蛋白质定量分析方法很多，采取定量分析方法不一样其测定基本原理也同；得到结果有一定差异。每一个测定方法有它优点，也有

3、它不足之处。在实际工作中要依据蛋白质特征采取对应方法。在很多分析方法中使用最多是比色法。下面分别简单介绍各种定量分析基本原理和方法。第5页1.3测定基本条件 待测溶液在一定波长照射下会产生光吸收，在一定浓度范围内光吸收值大小与溶液浓度成正比。所以只要测出待测溶液光吸收值和基准溶液光吸收值。便可知道待测溶液浓度，推算出蛋白质含量。比色分析要考虑以下几个条件：(1)溶液 在蛋白质定量分析中，大部分都足采取比色法，而比色法溶液可分两大类，即一类是有色溶液，另一类是无色溶液。第6页1. a.有色溶液 这是依据蛋白质与一些化中试剂反应生成一类有色溶液，该溶液能与单色光含有互补作用，生成互补色。利用光互补

4、原理进行比色测定。有色溶液包含以下二种 本色溶液：蛋白质分子中含有变色基团或显色基团，在溶液中会产生颜色，如血红蛋白，血蓝蛋白，铁蛋白，细胞色素C等。 显色溶液：蛋白质与一些化学试剂反应产生颜色，如双缩脲，福林酚，茚三酮等试剂。 染色溶液：蛋白质与一些燃料结合，被染上颜色，如考马斯亮蓝，氨基黑等染料。第7页b.无色溶液 依据蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，在280nm处有最大吸收峰，肽键在215nm处有最大吸收峰，利用最大吸收峰特征进行比色测定。 第8页(2)单色光单色光互补性：有色溶液与对应单色光生成新互补色第9页(4)朗伯-比耳定律(Lambert-Beer) 朗伯-比耳定律(Lambert

5、-Beer)，也称之为光吸收定律。比色测定要完全遵照朗伯-比耳定律。是指在一定浓度范围，溶液浓度与光吸收值成正比。用公式表示为： 光吸收值(A) =lg(1/T)= KCL T为透射比，K为常数，C为溶液浓度，L为光程（吸收层厚度） 朗伯-比耳定律同时反应了溶液厚度L和浓度C对光吸收关系，测定光吸收值随光波长、溶液浓度和溶液性质不一样而改变。第10页2测定方法：2.1比色测定2.1.1双缩脲法：(1)原理 蛋白质分子中含有肽键(CO-NH-)，所以，含有双缩脲反应特征。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，络合物颜色深浅与蛋白质浓度成正。所以它是蛋白质和肽类物质特异性测定方法。但此法测

6、定灵敏度不高，普通测试浓度在1-10mg之间，尤其适合于肽类物质测定。第11页(2)方法： 将蛋白溶液和双缩脲试剂显色反应，然后在540nm处比色测定，以牛血清清蛋白或者以被测蛋白标准品为基准液绘制标准曲线。(3)影响原因： 干扰双缩脲测定原因包含：在性质上类似于氨基酸化合物，如有机胺类肽缓冲剂，如Tris缓冲剂，可使Cu2+还原，出现红色沉淀物，干扰测定。第12页2.1.2福林-酚(Lowry)法：(1)原理： 福林-酚法测定蛋白质是在双缩脲法基础上发展起来。是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，然后该络合物再与还原磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生深蓝色溶液。此法适合于蛋白类定量分析，灵

7、敏度较高，测试范围在25-250g之间，但专一性不强。(2)方法： 将蛋白溶液利福林-酚试剂生成颜色反应，然后在640nm处比色测定，以牛血清清蛋白或者以被测蛋白标准品为基准液绘制标准曲线。(3)影响原因： 干扰此测定原因包含：在性质上类似于氨基酸或肽缓冲剂。如呈色反应，Cu2+轻易被还原，出现红色沉淀物，干扰测定。 第13页 2.1.3考马斯亮蓝法：(1)原理： 考马斯亮蓝G250是一个甲基取代二苯基甲烷，分子中含有多个磺酸基染料，在465nm处有最大光吸收值。考马斯亮蓝G250磺酸基能与蛋白质结合形成复合物，引发该染料最大光吸收值位置发生位移，移至595nm处出现最大光吸收值。因为蛋白质-

8、染料复合物含有很强光吸收，可大大提升测定蛋白质灵敏度，对蛋白类定量分析，最低测试量在1g以上。第14页(2)方法： 将蛋白溶液和考马斯亮蓝G-250试剂反应生成深蓝色，然后在595nm处比色测定。以牛血清清蛋白或者以被测蛋白标准品为基准液绘制标准曲线。(3)影响原因： 一些去污剂如Triton-100，SDS等对测定都有一定干扰。 第15页2.2紫外光吸收法：2.2.1标准曲线法(1)原理： 蛋白质分子中含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，组氨酸等)，在280nm处有最大吸收峰。蛋白质在最大吸收峰max波优点吸光值强弱与蛋白浓度成正比。这种方法适合于蛋白质分子中含有较多芳香族氨基酸蛋白质进行定

9、量分析，对一些含芳香族氨基酸较少蛋白质，测定灵敏度较低，如胶原蛋白。第16页(2)方法： 在实际工作中紫外光吸收法最惯用一个蛋白质方法，它是以配制一系列不一样浓度蛋白质标准溶液以不含被测蛋白溶液为参比溶液，在一样条件下测定标准溶液吸光度，将测得数据绘制成标准曲线，然后在一样条件下测定未知样品吸光度，从标准曲线上查得未知样品浓度。此法测量比较准确，但使用标准曲线隔一段时间进行校正。第17页2.2.2消光系数法：(1)原理： 蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，在280nm处特定吸光值。蛋白质分子中所含氨基酸数量不一样，它们在280nm处吸光值强弱就有差异。所以，每一个纯单一蛋白质在280nm处有一个特

10、定消光系数。假如已知某个蛋白质消光系数，只要在280nm处测定出该蛋白吸光值就能够计算出其对应含量。计算公式以下：第18页 测得吸光值 N 1000 测得吸光值 N 10蛋白质浓度(mg/m1) = = 消光系数 100 消光系数 式中N为稀释倍数，10是常数，是指在标定消光系数时，蛋白溶液浓度为100ml溶液中含有1000mg蛋白质，在计算公式中约分得到常数10。 第19页比如：胰蛋白酶消光系数是13.5。将胰蛋白酶溶液稀释100倍，测得光吸收值是0.27，经过上述公式计算其浓度。 0.2710010 蛋白质浓度(mg/m1) = = 20 13.5第20页(2)方法： 将待测蛋白稀释成一定

11、浓度在280nm处测定吸光值(测得吸光值处落在0.1-1.0范围内)。(3)影响原因： 在蛋白质混合溶液中或在280nm有干扰物质存在时，对该溶液测定都有较大影响。不含有普遍性。测试灵敏度所不一样。 第21页2.2.3 F因子测定法(1)原理： 因为蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基苯环含有共轭双键，所以，蛋白质含有吸收紫外光性质。最大吸收峰波长在280nm处。而在波长 260nm处光吸收较弱。这两种波长吸光值强弱与浓度成正比。经过测定蛋白质溶液在280nm和260nm处光吸收值，求出A280/A260比值，从表中查出F因子，经过计算公式能够计算出待测蛋白质含量。第22页 蛋白质浓度(mg/m1)

12、 = F(l/d) A280 N F：F因子 d：比色杯厚度 N：稀释倍数(2)方法 取一定浓度蛋白溶液，分别测定280nm和260nm处光吸收值。求出A280/A260比值，从F因子表中查出F因子。紫外吸收法测定蛋白质含量A280A260比值与F因子关系见表1第23页 表1紫外吸收法测定蛋白质含量F因子表1A280/A269F因子A280/A269F因子1.751.1160.8460.6561.631.0810.8220.6321.521.0540.8040.6071.401.0230.7840.5851.360.9940.7670.5651.300.9700.7520.5451.250.9

13、440.7300.5081.160.8990.7050.4781.090.8520.6710.4221.030.8140.6440.3770.9790.7760.6150.3220.9390.7430.5950.2780.8740.682第24页2.3定氮法4.3.1凯氏定氮法：(1)原理： 因为每一个蛋白质都有其恒定含氮量(约为14-16)，只要测出其氮元素含量就能够推算出其蛋白质量。所以，能够经过测定有机化合物或蛋白质分子中氮元素含量来推算蛋白质含量。计算公式以下： 蛋白质(mg/ml) = 测得含氮量 14 6.25 凯氏定氮法是将含氮有机化合物或蛋白质与浓硫酸共热硝化，有机氮转变成氨，

14、氨又与硫酸结合生成硫酸铵，硫酸铵在碱性条件下被分解，放出氨气，用水蒸汽蒸馏将氨气蒸出，硼酸吸收，然后用标准碱溶液进行滴定。第25页 (2)试验方法： 蛋白质消化氨硫酸铵氨硼酸铵滴定含氮量 蛋白质含量。 凯氏定氮法是一个经典方法，灵敏度高，使用仪器比较简单，但操作比较繁琐，影响原因较多，日前使用不多。(3) 影响原因: 空气中氨气, 标准碱浓度第26页凯氏定氮装置1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生瓶第27页2.3.2原子吸收光谱法(1)原理： 基本理是经过原子灯发出被测元素特征谱线在经过原子化器时，被待测元素基态原

15、子所吸收，使原子灯发出被测元素特征谱线强弱发生改变，经过检测特征谱线改变来测定原子吸收光谱，利用这些光信号改变强弱测定化合物中各种元素含量。利用这一性质，经过原子吸收光谱仪测定蛋白质中氮元素便可计算出蛋白质量。(2)方法： 经过原子吸收光谱仪直接测定蛋白质氮元素，或者通消化后测定消化液中氮元素。这种经典方法测试灵敏度高，操作比较简单，但需要大型原子光谱仪，普通试验室不具备。第28页2.4重量法：(1)原理： 在溶液中同时存在挥发性溶剂和非挥发溶质，结冰溶剂在高真空度条件下直接升华，溶质被干燥，取得蛋白质干粉，然后进行重量分析。(2)方法： 准确吸收一定蛋白质溶液冻干，恒重后，称重，即得蛋白质重

16、量。这种方法适合用于比较宝贵样品，重量法要求天平精度比较高。 第29页3定量分析应注意问题 要使分析方法有较高灵敏度和准确性，选择最正确测定条件：是十分主要。它包含仪器测量，试样反应和参比溶液等条件。2.1光学仪器最小测量误差： 任何分光光度计都有一定测量误差，这是因为光学系统稳定性差异所造成，试验条件瞬间改变，造成读数波动，对测定结果准确性有一定影响，尤其是试样浓度过高或过低均会引发误差。所以，测定时适当吸光度测量范围是很主要。依据Lamber-Beer定律，能够推出测定结果相对误差。第30页 若要使测定结果相对误差最小，经过Lamber-Beer定律方程解，从理论上得出相对误差最小值是：

17、吸光度(A) = 0.434 透光率(T) = 36.8。 也就是说吸光度读数应控制在光谱仪上最灵敏范围内， (A) = 0.434、(T) = 36.8。是仪器误差最小。第31页 浓度测量相对误差与溶液透射率(T)关系如图所表示：图1 第32页3.2比色测定呈色反应 在定量分析中，有许多物质测定是经过化学反应生成颜色后再进行比色测定，普通要注意以下问题(1)颜色反应后生成物必须在选定测定波长有较大光吸收(2)颜色反应后生成物理化性质必须稳定，显色条件轻易控制，重复性好(3)对照性好，反应物和生成物之间最大吸收波长之差，差值普通要在60nm以上。第33页 3.3参比溶液选择 依据样液性质不一样

18、，可选择不一样参比溶液。(1) 溶剂参比：当样液组分比较简单，与其它组分共存对所测定波长无任何吸收剂为参比。(2) 溶液参比：参加反应试剂在所测定波长部分干扰，可按照显色反应条件，选取不加被测试样品溶液为参比。(3)纯水参比：试样与共存组分在测定波长都有较大吸收，可选取水为空白，先测出试样和对照光吸收值，然后用试样吸收值减去对照光吸收值即可。第34页. 4定量分析小结 方法机理关键技术优点缺点比色法光互补色呈色反应应用广泛影响原因多紫外法最大吸收峰蛋白质纯度操作简单基准物有局限定氮法转化氮元素蛋白质消化结果准确步骤繁琐重量法冰点升华样品恒重结果准确专一性差第35页第二节 蛋白质纯度1概念1.1

19、蛋白质纯度 蛋白质纯度分析，是从蛋白质样品中确定目标蛋白和杂质分析方法，也是蛋白质分析中一类主要方法。任何一个蛋白质制品从理论上说都含有二类组分，即蛋白质和杂质。 蛋白质：是样品中主要成份，是分析目标蛋白 杂质：是残留非目标蛋白和残留小分子，无机盐等 所以，蛋白质纯度分析方法大致分为两类。第36页(1)目标蛋白与杂蛋白分析(2)目标蛋白与非蛋白分析 从广义上说蛋白质纯度普通是指样品中是否含有杂蛋白，不包含无机盐和有机小分子分析判定。因为有些蛋白质要在一定无机盐和有机小分子保护下才比较稳定。所以，一些产品中要添加一些小分子化合物。不过假如要进行蛋白质含量测定，则要包含杂蛋白，无机盐和有机小分子测

20、定。第37页1.2蛋白质纯度表示方法 一个天然蛋白或一个重组蛋白质，产品纯度是一个主要指标。纯度表示方法主要依据实际用途区分。如化学试剂纯度一样，主要有化学纯，分析纯，优级纯等。蛋白质纯度通常有两种方式表示。(1)工业用用百分含量表示：如：95、99、99.9(2)试验室用以用途表示： 有试验室级纯(1ab) 电泳纯(electrophoresis) 色谱纯(choromatography)。第38页2分析方法：2.1光谱法：2.1.1光谱扫描法： 一个纯度蛋白质溶液在一定波长范围内进行光谱扫描就会得到一个特征吸收光谱，能够依据扫描光谱吸收曲线形状，吸收峰位置，数量和大小判断该蛋白纯度。 用紫

21、外吸收光谱测定样品纯度，既方便又灵敏，测得结果可靠，是惯用纯度分析方法。 光谱分析特点：主要是判别目标蛋白质和非蛋白类杂质。第39页 2.1.2光吸收比值法： 一个纯物质在紫外光区有其最大光吸收峰，如核酸最大吸收峰在260nm，蛋白质最大吸收峰在280nm。同一溶液在这两种波场下测得光吸收值是不一样。利用在280nm和260nm处测得光吸收值之比，即可得到蛋白质纯度。如纯核酸标准光吸收比为A280/A260 = 0.5、纯蛋白标准光吸收比为A280/A260 = 1.8。 特点：仅限于蛋白质溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白质纯度测定。 含有核酸蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此

22、吸收差值，用下面经验公式，即可算出蛋白质浓度。蛋白质浓度=1.45A2800.74A260 (mg/ml)此经验公式是经过一系列已知不一样浓度百分比蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）混合液所测定数据来建立第40页 2.2层析法：2.2.1原理：一个纯蛋白质在稳定层析条件下，得到保留值只有一个，假如得到层析峰多于一个就能够视为不纯。所以依据层析峰数量判断物质纯度。层析法判定蛋白质纯度方法有：(1)保留值法 在一定层析条件下各种蛋白质组分在层析柱内保留值是一定，经过测定蛋白质层析保留值(保留时间，保留体积)就能确定蛋白质组分，从而能够判断蛋白质纯度。如：排阻层析依据蛋白质不一样分子量可得到不

23、一样保留体积，若流速恒定条件下，其保留时间也是一定。图2 第41页第42页 (2)基准物标定法： 已知物内标法，在被判定物样品中加入己知基准物，称内标物。经过层析分离，从得到层析峰增高或峰位置来判断。图3第43页 第44页 2.2.2层析模式 层析分析判定法方法很多，但依据层析分离机理利方法来分类，大致可分为以下几类。依据蛋白质质量和分子形状层析分离模式依据蛋白质疏水基团多少和分子极性差异层析分离模式依据蛋白质带电荷多少和分子吸附基团差异层析分离模式。惯用分离模式有： 排阻层析 疏水层析 吸附层析 高效液相第45页(4)几个色谱方法比较方 法机 理关键技术优 点缺 点排阻层析分子量分离层析介质

24、应用广泛分析时间长疏水层析极性分离缓冲溶液分离度好盐浓度较高吸附层析电荷分离介质性质通用性好条件难控制高效液相极性分离溶剂系统灵敏度高高纯有机溶剂第46页2.3电泳法：2.3.1原理： 一个纯蛋白质在一定电泳条件下得到电泳图谱只有一个条带，如聚丙烯酰胺电泳(PAGE)。所以依据蛋白质电泳条带数量判断蛋白质纯度。2.3.2方法： 电泳判定蛋白质纯度方法有: 净电荷电泳(PAGE) SDS-电泳(SDS) 等电聚焦电泳(IEF) 双向电泳(2D) 毛细管电泳(CE)第47页 2.3.3几个电泳方法比较方 法机 理关键技术优 点缺 点PAGE电荷分离蛋白带电性整分子分离不知分子量SDS质量分离蛋白质解聚单链分子分离不是整分子IEF等电点分离两性电解质等电点不知分子量2D电荷+质量第一向分离等电点+分子量操作