临床免疫学检验：沉淀反应

1、 沉淀反应 Precipitation9/5/2022沉淀反应： 是指可溶性抗原和抗体特异性结合，在适当条件下形成沉淀物的现象，其特性与经典的抗原抗体反应相同，包括液相沉淀试验和凝胶内沉淀试验。 （与凝集反应的异同？）9/5/2022沉淀反应的类型： 液相沉淀反应 凝胶中沉淀反应 免疫浊度分析 （本质为液相沉淀反应）9/5/2022第一节 液相沉淀反应(fluid phase precipitation) 指可溶性抗原与相应抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。9/5/2022液相内沉淀分为 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度分析9/5/2022一、絮状沉淀试验基本原理：可溶

2、性抗原与相应抗体在有电解质存在的条件下，形成可见的絮状沉淀物。用于抗原定性检测或抗原抗体反应最适比滴定。方法：玻片法和试管法。特点：方法简单、不需特殊设备、灵敏度低、已被其它方法取代。表6-1 最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5+ + + + + + +1/10+ + + + + + +1/20+ + + + + + +1/40+ + + + +1/80+9/5/2022二、 环状沉淀试验 基本原理：将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白色沉淀环 。主要用于抗原定性检测。 特

3、点：方法简单、不需特殊设备、但敏感度较低，已其他方法被取代。9/5/20229/5/2022第二节 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation) 凝胶内沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体分别放入凝胶内进行扩散，二者在比例合适的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环，又称凝胶扩散(gel diffusion)。 9/5/2022凝胶内沉淀试验分为： 自由扩散：单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验 定向扩散：火箭电泳 对流免疫电泳 定向-自由扩散：免疫电泳 免疫固定电泳9/5/2022一、自由扩散（一）单向琼脂扩散试验 single immunodiffsion1、基本原理 待测抗原在含有

4、相应定量抗体的凝胶内从局部自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在二者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环大小与抗原的浓度成正相关。 抗体+琼脂沉淀环抗原倾注平板打孔加样 放置372448h观察沉淀环 单向扩散试验（平板法）9/5/20229/5/20222、技术要点 制板：将抗体和热融化琼脂混合，倾注成平板。 打孔： 加样：待测抗原和抗原标准品， 反应：置37，2448h后观察孔周围沉淀环。9/5/20223、 数据处理 （1）Mancini曲线 适用于大分子抗原，如IgM测定，扩散时间48h. 沉淀环直径的平方（d2）与抗原浓度（C）呈线性关系。 9/5/2022（2）Fahey曲线 适用

5、于小分子抗原，扩散时间较短(24h). 抗原浓度的对数（log c）与沉淀环直径（d）呈线性关系。 9/5/20224、临床应用 用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量测定。 简单、特异，但敏感性低，已被其它方法取代。9/5/2022（二）双向琼脂扩散试验（double immunodiffusion）1、基本原理 将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者均在凝胶中自由扩散，当抗原与抗体相遇，浓度比例适当处形成可见的白色沉淀线。 9/5/2022（二）技术要点 琼脂倾注制板。 待琼脂凝固后，在琼脂胶板上打孔。 在相对的孔中分别加入抗原或抗体。 置室温或371824h观察沉淀线

6、。应用（1）抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计 （2）抗原或抗体相对分子量的估计 双向扩散试验 （平板法）应用（3）抗原性质的分析 双向扩散试验 （平板法）应用（4）抗体效价的滴定 （5）抗原或抗体纯度的鉴定 双向扩散试验 （平板法）9/5/2022（三）方法评价 方法稳定、简便，不需特别仪器设备，重复性好，但灵敏度稍差(1.25mg/L)。9/5/2022（四）临床应用1、血清学诊断:出现沉淀线，表明存在相应的Ag或Ab。2.免疫化学分析：浓度、分子量、纯度、抗原性质分析和抗体效价滴定等。 9/5/2022二、定向免疫扩散 在电场作用下，抗原抗体在介质中发生定向移动的沉淀反应。定向、加速

7、扩散 9/5/2022分类 对流免疫电泳 (counter immunoelectrophoresis) 火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis) 9/5/2022(一)对流免疫电泳对流免疫电泳 是双向免疫扩散与电泳相结合，在电场中加速定向扩散的双向免疫扩散技术。 9/5/20221. 基本原理 在pH8.6的琼脂凝胶中， 大部分蛋白质抗原在碱性溶液中带负电荷，且分子较小，电泳时，泳向正极。 抗体带弱负电荷，但分子量大，电泳力小于电渗力，泳向负极。 抗原和抗体相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。9/5/20229/5/20222.技术要点 制板，在琼脂板上成

8、对打孔，加抗原和抗体。电泳后观察结果。 9/5/20223.方法评价操作简便。灵敏度较高，比双扩高约10倍。分辨率低于双扩。9/5/20224. 临床应用常用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴定等9/5/2022(二) 火箭免疫电泳火箭免疫电泳 是将单向免疫扩散和电泳相结合，在电场中加速定向扩散的单向免疫扩散技术，由于其沉淀形似火箭，故称为火箭电泳。 9/5/20221. 基本原理 电泳与反应 抗原在电场作用下，在含有适量抗体的凝胶中向正极泳动，逐渐形成梯度浓度，在抗原抗体比例适当时形成沉淀，随着抗原量的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭峰样沉淀带，峰形高低与抗原量呈正相关。结果分析 用已知

9、量标准抗原作对照，绘制标准曲线，根据检测样品沉淀峰的高度可算出待测抗原的含量。 9/5/20229/5/20222. 技术要点 制板与打孔：结果：电泳完毕，观察琼脂板上沉淀峰，测量(从孔 中心到峰尖的高度)。计算: 以峰高为纵坐标，抗原浓度为横坐标(对数 坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品抗原浓度。 电泳：样品孔侧置负极电泳。9/5/20223.方法评价操作简便灵敏度较高（mg/L）9/5/20224. 临床应用1. 抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM检测。2. C3、C4及其裂解产物检测。3. AFP等检测 已被免疫浊度分析取代。9/5/2022三、定向-自由扩散是将区带电泳与免疫扩散相

10、结合的免疫化学分析技术。类型：免疫电泳、免疫固定电泳9/5/2022（一） 免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP） 将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。 9/5/20221. 基本原理 电泳：Ag在凝胶上进行电泳，被分离成不同区带。反应：在停止电泳后，在与电泳方向平行挖一条槽，加入相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩散，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，可分析、鉴定样品中所含抗原成分及其性质。9/5/20229/5/20222. 技术要点制板与打孔：加样：加入待检抗原标本或正常血清对照。电泳：抗原一端接阴极，电泳1.5

11、2h。反应：挖一小槽，向槽内加入抗体，使抗原抗体双向扩散。观察结果：放置24h后，观察沉淀线的数目、形状和位置。 9/5/20229/5/20223、方法评价 特异、分辨率高抗体质量很关键（量足够、效价等）9/5/20224. 临床应用主要用于：纯化抗原或抗体的成分分析。异常体液中蛋白质分析，如无丙种球蛋白血症、白血病等病人的血清蛋白成分的分析。 9/5/2022(二) 免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis） 区带电泳与免疫沉淀反应相结合的免疫分析技术。 1、原理： 似免疫电泳，不同之处是电泳后直接将抗体作用于被分离的各组分蛋白质，抗Ag-Ab发生反应，使

12、Ag在电泳位置上被免疫固定。9/5/20222. 技术要点 电泳： 先将抗原作区带电泳，分离成不同区带。沉淀反应:电泳后，将Ab加于蛋白质区带表面，Ag与Ab发生沉淀反应，形成的CIC嵌于固相支持物中。洗去游离的Ag或Ab，显示出被结合固定的某种蛋白质。 左图为IgG 型, 中图为IgG 型，右为正常 SPGAM SPGAM SPGAM 免疫固定电泳示意图9/5/20223、方法评价简便、快速（1h）灵敏度高于免疫电泳9/5/20224.临床应用可用于鉴定具有近似迁移率的多种蛋白 如各种M蛋白、补体的裂解产物、免疫球蛋白的轻链型别；脑脊液、尿液或其他体液中微量蛋白的检测与鉴定。 9/5/202

13、2第三节 免疫浊度分析技术（immunoturbidimetry） 免疫浊度测定 是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分析技术相结合而发展起来的一项分析技术。当可溶性抗原与相应的抗体特异结合，可以形成不溶性的CIC，使反应液出现浊度。用仪器检测浊度，推算出复合物的量。 9/5/2022免疫浊度测定按测量方式分为 透射免疫比浊法 （turbidimetric immunoassay或turbidimetry） 散射免疫比浊法 （nephelometric immunoassay或nephelometry）Ag+Ab“电解质”IC（ 19S）浊度IC 浊度 待测Ag量Ab稍微过量且固定 待测抗

14、原量与反应溶液的浊度呈正相关浊度的检测分析免疫透射比浊法（turbidimetry） （吸光度）免疫散射比浊法（nephelometry） 自动化免疫浊度分析系统入射光线 样品 被吸收、反射、折射 减弱 吸光度与IC量呈正相关，IC量与参与反应的抗原的量呈函数关系（抗体过量且固定浓度）。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。（一）原理一、免疫透射比浊法 （二）技术要点1.稀释标本和标准抗原（5个浓度）.2.加适当过量抗血清，反应完成后，测各管A340nm。3.计算机处理:按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，计算出抗原浓度。（三

15、）方法评价 优点: 灵敏度提高，稳定性好，操作简便，结果准确。（较单扩法和火箭电泳而言） 不足: 抗体用量较大（过量）； IC要足够大(35-100nm)、足够多； 耗时较长。 吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关（一）原理二、免疫胶乳比浊法（二）方法评价敏感度高，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；RF可致非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG即可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。(一) 原理三、免疫散射比浊法光线照射 微粒子 反射和折射 散射光 散射光强度：与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关原理

16、：1、保证抗体过量； 2、避开不稳定阶段； 3、抗原过量的检测时段检测分两个在抗原抗体预反应时段，加小量样本， （7.5s2min）测定第一次散射光信号值加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号信号峰值计算机处理转换为样品浓度(二)定时散射比浊法（fixed time nephelometry） 仪器测定技术要点 抗原抗体预反应阶段： 1/10量标本，7.5120s内，散射光信号阈值，才行下一步，否则稀释后再行测定。(2) 反应阶段：全量标本测定，全过程需4min(3) 信号检测 ：计算机换算为待测抗原浓度定时散射比浊法的抗原过量检测 抗体适当过量（抗体结合抗原的能力可达到50倍于待

17、测标本正常血清浓度）。 (2)检测分阶段进行，第一阶段加小量样本，并对检测峰值进行阈值限定 ，超过阈值即进行稀释检测。原理：抗原抗体结合反应的动力学测定法。速率：单位时间内形成IC量（不是IC总量）速率峰值的大小与抗原浓度呈正相关。（三）速率散射比浊法（rate nephelometry）累计时间（s）形成IC总量速率累计时间（s）形成IC总量速率 5 810 13 515 251220 603525 1509030 2308035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20 抗原抗体复合物形成的速率仪器测定技术要点 开启机器，进行定

18、标 反应阶段 ：动态监测反应速度抗原过量检测-加入标本反应结束后再加入标准抗原，看是否出现第二个速率峰抗体过量第一峰值信号(四)散射比浊法方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量要求很高。 1.抗体的质量 （高质量R型抗体）2.抗原抗体比例（抗体适当过量） 3.反应条件（PH值、离子强度） 4.增浊剂的使用 （种类、浓度合适） 5.标本因素。（伪浊度产生原因？）免疫比浊分析的影响因素 四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用免疫比浊分析临床应用免疫球蛋白检测：IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体检测:C3、C4；血浆蛋白检测:前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列。9/5/2022沉淀反应液相沉淀反应 自由扩扩散：单扩、