补体实验报告

1、补体实验报告篇一：补体结合试验第二节 补体结合试验补体结合试验( complementfixationtest ， cft )是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。 早在 1906 年 wasermann 就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla 的检测和分析中也有应用。一、类型及原理自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的 激活 ， 最 后 形 成 膜 攻击 复 合 物 ( membrane attackcomplex ) ，它可以直接攻击红细胞膜，导致

2、红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血” 。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉” ，这就是所谓“血管外溶血” 。该试验中有5种成分参与反应，分属于 3个系统：反应系统， 即已知的抗原 (或抗体) 与待测的抗体 (或抗原) ；补体系统；指示系统，即 srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原） ，则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反

3、应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原） ，则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图 14-2 ） 。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。图 14-2 补体结合试验示意图二、试验方法补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法（3ml） 、 半量法 （1.5ml） 、 小量法 （0.6ml） 和微量法 （塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。 以下叙述以小量法为例， 即抗原、 抗体、 溶血素、羊红细胞各加

4、 0.1ml ，补体加 0.2ml ，总量为 0.6ml 。（一）试剂抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（ 100 不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价） 。滴定方法举例如表14-4 。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补

5、体和指示系统， 温育后观察结果。 在表 14-4 中可见 1:64 抗原和 1:32 抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用 24 个单位（1:641:32 ）,抗体采用4个单位（1:8）。表 14-4 抗原和抗体的方阵滴定抗原 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512抗体对照抗血清稀释倍数1:4 4 4 4 4 4 4 3 0 01:8 4 4 4 4 4 2 1 0 01:16 4 4 4 4 4 1 0 0 01:32 4 4 4 4 0 0 0 01:64 4 4 3 3 2 0 0 0 01:128 4 3 2 1 0 0 0 01:2

6、56 3 2 2 0 0 0 0 01:512 2 1 0 0 0 0 0 0抗原对照 0 0 0 0 0 0 0 0注： 1、 2、 3 、 4 分别表示溶血反应强度、 、 、 ； 0 为不溶血。3补体滴定按表14-5 逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为 1 个实用单位，正式试验中使用 2 个实用单位。如形14-5 中的结果为 1:60 的补体0.12ml 可产生完全溶血，按比例公式 0.12 X 2:60 =02x 计算，x=50;即实际应用中的 2 个补体实用单位应为 1:50 稀释的补体0.2ml 。表 14-5 补体的滴定管号1:60 补体（ ml ） 缓冲

7、液（ ml ）稀释抗原（ ml ）致敏 srbc （ ml ）1 2 3 4 5 60.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.140.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.160.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1浴 30min 37 水 置 放0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2浴 30min 37 水 置 放不溶血 不溶血 微溶血 微溶血 全溶血 全溶血结果（二）血清标本采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于 20。 血清在试验前应先加热 56 30min（ 或 60 3min ） 以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象

8、时可做下列处理之一：加热提高12;20C冻融后离心去沉淀；以3mmol/l盐酸处理；加入少量补体后再加 热灭活；以白陶土处理；通入 co2;以小白鼠肝粉处 理；用含10%新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。（三）正式试验以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6 逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。 阴性、 阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2u 为全溶， 1u 为全溶略带有少许红细胞，0.5u 应不溶。 如 0.5u 补体对照出现全溶表明补

9、体用量过多；如 2u 对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。表 14-6 测定抗体的补体结合试验操作程序反应物（ ml ） 待检血清管测定稀释血清 抗原 缓冲液 2u 补体 1u 补体 0.5u 补体 致敏红 细胞混匀，置37 30min 后观察结果0.1 0.1 0.2 0.2 TOC o 1-5 h z 对照0.10.10.20.2阳性对照管测定0.1 0.1 0.2 0.2对照0.10.10.20.2阴性对照管测定0.1 0.1 0.2 0.2对照0.10.10.20.2抗原对补体对照管 照管 0.1 0.

10、1 0.2 0.22u 0.1 0.1 0.2 0.21u 0.1 0.1 0.2 0.20.5u 0.1 0.1 0.2 0.2 0.4 0.2红细胞对照管混匀，置37 C1h或4 c 1618h三、应用和评价 补体结合试验是一种传统的免疫学技术，能够沿用至今说明它本身有一定的优点：灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05以g/ml的抗体，可与间接凝集法的灵敏度相当。特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。应用面广，可用于检测多种类型的抗原或抗体。易于普及，试验结果显而易见；试验条件要求

11、低，不需要特殊仪器或只用 光电比色计即可。补体结合试验可应用在以下几方面：传染病诊断。病原性抗原及相应抗体的检测。其他抗原的检测。例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、hla分型等。自身抗体检测。但是补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁锁并且要求十分严格，稍有疏忽便会得出不正确的结果，所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。篇二：医学免疫学 CDC验报告CDC 验一 . 实验原理细胞表面抗原与相应的抗体（IgG13或IgM）特异性结 合形成的免疫复合物，可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜穿孔。因此，水溶性染料

12、如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳性反应；不带抗原的细胞，未损伤，不染色，为阴性反应。 二. 实验步骤 1. 胸腺细胞悬液制备 颈椎脱臼法处死小鼠J暴露胸腔，分离由胸腺J银子夹住胸腺反复轻轻研磨；单个细胞PBS洗 2 次，1000rpm, 10min J加入5%小牛血清PBS 制备细胞悬液调节细胞浓度至3-4 X 107/ml三 . 结果判断细胞膜穿孔的细胞呈蓝色，细胞膜完整的活细胞不着 色。 细胞毒性作用的判断标准如下： 阴性反应 ( ) 死细胞占 0-10% 可疑阳性反应 ( ) 死细胞占 11-20% 弱 阳性反应 ( + ) 死细胞占 21-50% 阳性反应 ( + ) 死细胞 占

13、 51-80% 强阳性反应(+ ) 死细胞占 81-100%四. 结果记录表格记录照片展示五 . 讨论.第组成阳性的原因：实验中加入抗原、抗体、补 体、LC。抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物，通过经典途 径激活补体，形成攻膜复合物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台盼蓝进入细胞，染成蓝色，呈阳性反应。说明 CDC 实验必须要有抗原、抗体、补体共同参与。.第组成阴性的原因：实验中加入抗体、LCo因为无抗原和补体，不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复合物， 不能使细胞膜穿孔， 细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能被染成蓝色，呈阴性反应。说明CDC验必须要有补体的参与。.第组呈阴性

14、的原因：试验中加入LC和补体，因为无抗原抗体，所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反应。说明CDCU验必须要有抗原、抗体的参与。.第组呈阴性的原因：实验中只加入 LC,既无抗原抗体免疫复合物的形成，也无补体，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反应。说明CDCU验必须要有抗原、抗体、补体的共同参与。篇三：实验三 补体溶血实验实验三 补体溶血实验一、实验目的：了解溶血反应的原理，掌握溶血反应的基本操作方法二、实验原理：将绵羊红细胞做抗原注射家兔体内，经一定潜伏期，家兔血清中即出现特异性抗体， 此种抗体称溶血素， 它可以与绵羊红细胞结合，此时若加入补体，即可激活补体的经典途径，则呈现溶血现象。三、