乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

1、乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建【摘要】目的为了讨论HBx基因与肝癌发生的关系，构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyT腺病毒载体系统，首先从质粒pDNA3.l-HBx中酶切得到HBx基因，插入腺病毒穿梭质粒pAdTrak-V中，得到pAdTrak-V-HBx，将其Pe酶切线性化后，转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中，通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd-HBx，经Pa酶切线性化后转染人胚肾293细胞，产生重组腺病毒颗粒Ad-HBx。结果PR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad-HBx构建成功，在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功

2、构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体，为后续研究奠定了基矗【关键词】乙型肝炎病毒;HBx基因;腺病毒载体Abstrat:bjetiveTestablisharebinantadenvirusvetrarryingHBxgenesastexplretherelatinshipbeteenHBxgeneandthepathgenesisfhepatellulararina.ethdsByusingAdEasyTadenvirusvetrsyste,arebinedshuttlevetrasnstrutedthrughthelnefHBxgeneintpAdTrak-V,thenthevetrpAd

3、Trak-V-HBxaslinearizedusingPeandtransfredintBJ5183ellithpAdEasy-1tgeneraterebinedadenvirusplasidpAd-HBxthrugheletrpratin.Subsequently,theplasidaslinearizedithPaandtransfetedint293ellstpakintrebinedadenvirusAd-HBx.ResultsPR,DNAsequeneandrestritinendnuleasedigestinanalysisindiatedthattherebinedadenvir

4、usvetrAd-HBxarryingHBxgenehadbeensuessfullynstruted.GreenfluresentprtEin(GFP)asbservedunderthefluresentirspe.nlusinArebinantadenvirusvetrntainingHBxgeneassuessfullynstrutedandlaidbasisfrsubsequentstudies.Keyrds：hepatitisBvirus;HBxgene;adenvirusvetr原发性肝癌(H)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染与H的发

5、生亲密相关，而HBVX基因编码的HBx蛋白在HBV相关性肝癌发生开展中起关键作用1。本实验采用pAdEasyT重组腺病毒系统，构建HBx基因重组腺病毒载体(Ad-HBx)，为进一步研究HBx基因对肝癌开展的影响提供可靠的基因转移工具。1材料和方法1.1材料真核表达载体质粒pDNA3.l-HBx由本实验室构建并保存2，pAdTrak-V腺病毒质粒、含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌、人胚肾293细胞株及空白对照腺病毒Ad由徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心胡书群博士惠赠。Pe酶、Pa酶购自NEB，其余限制性核酸内切酶及T4DNA连接酶、PR试剂盒、质粒DNA回收纯化试

6、剂盒为美国Prega公司产品，Effetene转染试剂盒为德国Qiagene公司产品。1.2方法1.2.1pAdTrak-V-HBx重组穿梭质粒的构建用Hind和ER双酶切pDNA3.1-HBx，获取HBx基因，克隆到腺病毒载体pAdTrak-V(同样Hind/ER双酶切)中。得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrak-V-HBx。经PR、酶切验证后送invitrgen(上海)英骏生物技术测序。1.2.2pAdTrak-V-HBX与pAdEasy的同源重组将正确重组的穿梭质粒pAdTrak-V-HBx用Pe酶切线性化，电转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183细菌。卡那霉素选择性

7、培养基挑选阳性克隆，挑取最小的克隆扩增培养，提纯质粒。用Pa酶切鉴定质粒，鉴定成功的重组子再次转化感受态DH5细菌，挑选阳性克隆并提取纯化，得到含HBx基因的重组腺病毒质粒pAd-HBx。1.2.3重组腺病毒在293细胞内的包装和扩增经Pa酶切线性化的重组腺病毒质粒pAd-HBx转染293细胞，按照Effetene转染试剂说明书操作。37、5%2培养箱中孵育，2448h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，710天后搜集包装细胞，反复冻融4次以收获重组腺病毒Ad-HBx，将病毒冻融上清液反复感染293细胞以大量扩增并收获病毒。1.2.4重组腺病毒Ad-HBx目的基因鉴定5l病毒上清

8、液加上10lPR-gradePrteaseK，55消化1h，然后煮沸样品5in，离心后取12l进展PR反响，证实重组腺病毒基因组中含有HBx基因。2结果2.1重组腺病毒穿梭质粒pAdTrak-V-HBx的鉴定用Hind/ER酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱以及采用HBx基因全序列的上下游引物其PR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱上都可见一条465bp的条带，与目的基因HBx的DNA片段一致。测序结果也证实重组腺病毒穿梭质粒pAdTrak-V-HBx中HBx的碱基序列与文献报道一致。转贴于论文联盟.ll.2.2重组腺病毒表达质粒pAd-HBx的鉴定用Pe酶切线性化pAdTrak-V-HBx与pAdEasy-1

9、在BJ5183细菌中进展同源重组，结果得到重组腺病毒载体质粒pAd-HBx。用Pa酶切重组腺病毒表达质粒pAd-HBx，0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，有30kb和3.0kb的2个条带(图1)，证实穿梭质粒和骨架质粒同源重组成功。2.3重组腺病毒Ad-HBx的包装含重组腺病毒的质粒pAd-HBx转染包装细胞293，在2448h后，荧光显微镜下可观察到GFP的表达(图2)，说明重组腺病毒在293细胞中已开场病毒包装。710天后可观察到细胞病变(PE)，大局部包装细胞肿胀脱落。2.4重组腺病毒Ad-HBx的鉴定PR鉴定结果证实重组病毒Ad-HBx基因组中含有目的基因，电泳显示465bp的单一条带(图3

10、)。3讨论HBx基因编码的X蛋白是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等3。本实验采用限制性内切酶从重组质粒pDNA3.1-HBx得到HBx基因，应用pAdEasyT重组腺病毒系统在原核细胞大肠杆菌BJ5183内进展同源重组4，大大进步了病毒的重组效率。AdEasyT重组腺病毒系统中腺病毒骨架质粒含有不完好的腺病毒基因，缺失E1区(1-3533)和E3区。E1区为病毒复制所必需，人胚肾细胞293细胞可以补充E1区。重组穿梭质粒含有目的基因

11、HBx基因、V启动子、GFP基因、卡那霉素(Kana)耐药基因、限制性内切酶Pa位点和Pe位点。将穿梭质粒用Pe酶切线性化后，电转化至含有骨架质粒的感受态细菌BJ5183中进展同源重组5，利用卡那霉素抗性挑选重组体。重组成功的质粒用Pa线性化，转染293细胞，得到可表达HBx蛋白的重组腺病毒载体。观察其在293细胞中GFP的表达情况，检测HBx蛋白的表达，从而确定重组腺病毒Ad-HBx构建成功。本实验构建的携带HBx基因的重组腺病毒载体，具有转染效率高、易检测观察(GFP为报告基因)的优点，为下一步研究HBx对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程的机制建立

12、基矗【参考文献】1HangGY,LinY,HuangL,etal.DetetinfthehepatitisBvirusXprtEin(HBx)antigenandanti-HBxantibdiesinasesfhuanhepatellulararinaJ.Jlinirbil，2022，41(12):5598-5603.2尤红娟,裴冬生,孙伟,等.乙型肝炎病毒X基因DNA的克隆及真核表达载体的构建J.徐州医学院学报,2022,26(3):191-193.3汪琼,董俊兴.乙型肝炎病毒X基因及HBx蛋白的研究进展J.生物技术通讯,2022,17(1):78-80.4Zeng,SithSK,SiegelF,etal.AdEasysysteadeeasierbyseletingthevi