反硝化细菌项目说明书

1、筛选好氧反硝化细菌处理工业废水设计说明书设计者 吕海鹏 鹿宗贵 韩飞怡指导老师 柯涛（南阳师师范学院院生命科科学与技技术学院院 河南 南阳 44730061）摘要 通通过定向向富集，从污水水处理池池活性污污泥中筛筛选出具具有高效效降解亚亚硝态氮氮能力的的好氧反反硝化细细菌，并并在实验验室条件件下，对对该菌株株在天然然水体中中的反硝硝化活性性进行系系统的研研究，制制作出可可用于生生物脱氮氮的微生生态菌剂剂。该菌菌剂具有有成本低低、易操操作、达达标排放放可靠性性强且无无二次污污染等优优点。关键词 污水处处理厂 好氧反反硝化细细菌 微生态态制剂 生物脱脱氮作品内容容简介本研究是是以污水水处理池池中活

2、性性污泥为为原料，筛选出出具有高高效降解解亚硝态态氮能力力的好氧氧反硝化化细菌，生物脱脱氮以其其无污染染、脱氮氮彻底等等优点被被认为是是目前最最经济、有效、可行性性高的水水体除氮氮方法。但由于于种种原原因,目目前国内内外市场场尚无可可有效治治理水体体亚硝态态氮污染染的微生生态制剂剂产品。本研究究分离得得到的反反硝化菌菌菌株具具有良好好的脱氮氮效果。应用于于废水脱脱氮，能能适应各各种不良良的环境境条件，具有开开发成微微生态制制剂应用用于受污污染水体体脱氮的的巨大潜潜力。市市场潜力力大，应应用前景景广阔，具有显显著的社社会、经经济效益益，具有很很高的推推广应用用价值。本研究采采用定向向富集（反复筛

3、筛选）的的方法，从污水水处理池池活性污污泥中筛筛选出具具有高效效降解亚亚硝态氮氮能力的的好氧反反硝化细细菌。该该方法操操作简便便、可行行，反复复筛选具具有成本本低、易操作作、达标排排放可靠靠性强且且无二次次污染等等优点。具有较较好的科科学性和和先进行行。不仅仅降低了了工业废废水对水水体环境境的危害害，还可可制得环环保、高高效去除除水体富富营养化化的微生生物菌剂剂，由此此带来的的环境效效益和社社会经济济效益是是非常显显著的。按本方法法筛选到到的好氧氧反硝化化细菌市市场潜力力大，推推广应用用前景广广阔，具具有显著著的经济济效益我我国每年年用于环环境污染染投资约约为8330亿元元，约占占当年GGDP

4、的的1%。尽尽管如此此，水环环境污染染趋势仍仍然没有有得到有有效控制制，每年年由于水水质污染染引起的的损失共共约为5500亿亿元。同时，项目实实施后可可安排社社会闲散散人员就就业，减减轻就业业压力，产生较较好的社社会效益益。利用用活性污污泥筛选选出TIIN 去去除率较较高的好好氧反硝硝化细菌菌，不仅仅能减少少工业废废水对环环境的污污染，而而且能充充分利用用资源，变废为为宝，具具有显著著的环境境效益。联系人：吕海鹏鹏 115899338864884 lvvhaiipenngnyynu1633.coom 研究背景景及意义义20世纪纪60年年代以来来，世界界上水体体污染达达到极为为严重的的程度，震惊

5、世世界的几几起公害害事件相相继发生生，引起起了科学学界和政政界的重重视，保保护环境境，治理理污染成成了人们们普遍关关注的问问题，而而工业废废水的不不合理排排放更是是关注的的焦点。我国每每天排放放大量的的工业的的废水，对江河河湖海造造成严重重的污染染。据统统计，全全国277条主要要河流，大多数数被严重重污染，工业废废水的不不合理排排放不仅仅增加水水处理的的难度和和用水成成本，还还引发严严重的生生态问题题，导致致江河湖湖海含有有过量的的氮、磷磷营养物物质，使使藻类和和其他水水生生物物大量繁繁殖，造造成水质质恶化，形成水水体“富富营养”和“水水华”现现象。同同时我国国是世界界水产生生产大国国，水产产

6、品总量量十几年年来一直直位居世世界第一一。据统统计，220044年我国国水产养养殖总产产量达到到32009万吨吨，占世世界水产产养殖产产量的三三分之二二以上。但目前前主要采采用的集集约化高高密度养养殖，如如施肥给给饵和密密集轮养养等养殖殖方式，会在养养殖水体体中积累累大量的的鱼类粪粪便、食食物残渣渣和死亡亡的动植植物尸体体，导致致水体氮氮素含量量严重超超标，富富营养化化情况严严重，鱼鱼虾病害害频频发发生，给给水产养养殖业尤尤其是高高档精养养池塘造造成巨大大损失。作为水水体氮素素存在形形式之一一的亚硝硝酸盐的的控制一一直是水水产科学学工作者者研究的的热点。这是因因为它是是水产动动物致病病的根源源

7、之一，其危害害主要表表现在它它可以将将鱼虾体体内的亚亚铁血红红蛋白氧氧化成高高铁血红红蛋白，使其丧丧失运输输氧的能能力，从从而造成成鱼虾的的窒息死死亡。我我国淡水水渔业用用水标准准规定, 养殖殖水质中中的亚硝硝酸盐氮氮应控制制在0.2pppm以下下，河蟹蟹、对虾虾育苗水水质的亚亚硝酸盐盐氮应控控制在00.1pppm以以下。 本项目目研究的的生物修修复技术术是一种种治污新新模式，通过定定向富集集，从污污水处理理池活性性污泥中中筛选出出TINN 去除除率较高高的好氧氧反硝化化细菌，并在实实验室条条件下，对该菌菌株在天天然水体体中的反反硝化活活性进行行系统的的研究，制作出出可用于于生物脱脱氮的微微生

8、态菌菌剂在废废水处理理方面,同步硝硝化反硝硝化相对对于传统统的生物物脱氮工工艺具有有明显的的优势。通过微微生态制制剂的直直接投放放，以及及鱼类和和水生植植物的协协同作用用达到净净水的目目的。它它具有高高效、无无二次污污染，成成本低、投资省省，使用用简单易易操作等等特点。本着消消除污染染，筛选选高效去去除水体体富营养养化的微微生物菌菌剂，进进而促进进经济的的可持续续发展。利用活活性污泥泥筛选出出TINN 去除除率较高高的好氧氧反硝化化细菌，不仅能能减少工工业废水水对环境境的污染染，而且且能充分分利用资资源，变变废为宝宝，具有有显著的的环境效效益。2 作作品研究究内容2.1研研制目的的本着充分分利

9、用资资源、消消除污染染，制取取可高效效去除水水体富营营养化的的微生物物制剂，促进经经济的可可持续发发展为目目的。而而从活性性污泥中中筛选好好氧反硝硝化细菌菌。2.2实实验材料料和方法法 2.22.1实实验主要要仪器、原料及及试剂主要仪器器:超净净工作台台（SWWCJ-A），高压压蒸汽灭灭菌锅，恒温培培养箱(SPXX-1660型)，摇床床（HNNY-2200DD），电子子天平等等。主要原料料及试剂剂:BTTB培养养基（琼琼脂200 g、KNOO3 11 g、KH22PO44 1 g、FeCCl26H22O 00.5 g、CaCCl27H22O 00.2 g、MgSSO47H22O 11 g、琥珀

10、酸酸钠8.5 gg、溴百里里酚蓝(BTBB)(11%乙醇醇溶液)1 mmL，用用1 mmol/L 的的NaOOH 调调节pHH 至7.007.33，1211 灭菌200 miin），LB培培养基（KNOO3 11 g、KH22PO44 1 g、FeCCl26H22O 00.055 g、CaCCl27H22O 00.022 g、MgSSO47H22O 11 g、琥珀酸酸钠8.5 gg，1211 灭菌200 miin）。格里斯斯试剂AA、B液液，二苯苯胺试剂剂，其他他试剂均均分析纯纯。取样 南阳市污污水处理理厂曝气气池中活活性污泥泥；南阳师院院十二里里河污泥泥；南阳师院院阳子湖湖湖水；南阳师院院周

11、围麦麦田土样样。2.2.3实验验方法2.2.3.11.好氧氧反硝化化细菌的的初筛采用梯度度稀释法法将污泥泥样品稀稀释至适适当浓度度，取00.1 mL 均匀涂涂布于BBTB 培养基基表面，置入恒恒温培养养箱，330 下培养养23 dd 后，用接种种环挑取取使周围围培养基基出现蓝蓝色晕圈圈的单菌菌落，进进行分离离纯化即即为初筛筛菌株。2.2.3.22.好氧氧反硝化化细菌的的复筛将初筛筛筛选出的的好氧菌菌株接种种到LBB液体培培养基的的试管中中, 每每支试管管分装培培养基的的高度约约为 445ccm，每每株重复复 3 管，在在 300恒温温下培养养 7dd 以上上，每天天观察其其生长情情况，检检查试

12、管管是否混混浊。并并用格里里斯（GGrieess）试剂检检查培养养液中是是否已出出现亚硝硝酸根。如果呈呈桃红或或红色反反应，说说明硝酸酸盐已经经在反硝硝化菌作作用下生生成亚硝硝酸盐，即为正正反应。如为负负反应，则就要要检查培培养液中中是否还还有硝酸酸根，即即置白瓷瓷板凹窝窝中加浓浓硫酸和和二苯胺胺试液各各 2 滴，然然后滴入入待测液液 12 滴滴，如果果有蓝色色出现，说明有有硝酸根根存在，即未进进行反硝硝化作用用，受检检查管无无反硝化化细菌存存在，如如不出现现蓝色，则说明明硝酸根根已完全全消失，且作为为硝化作作用中间间产物的的亚硝酸酸根也完完全消失失，这证证明受检检查管的的反硝化化作用很很强烈

13、，有反硝硝化细菌菌存在，检查时时应与空空白对照照，将检检出具有有反硝化化作用的的好氧菌菌作为复复筛菌91，并将将其接种种于 33 号培培养基的的试管斜斜面，作作为备用用菌。2.3分分析方法法 该该方法是是利用在在培养液液中滴加加格里斯斯试剂、二苯胺胺试剂和和奈氏试试剂,通过显显色反应应指示亚亚硝态氮氮、硝态态氮和氨氨态氮的的变化 311 ,从而而筛选出出对硝态态氮有较较强利用用效果的的菌株。在培养养液中加加入12滴格里里斯试剂剂,以检测测是否有有亚硝酸酸盐的存存在,如溶液液立即呈呈粉红色色或棕色色等,则硝酸酸盐被还还原成亚亚硝酸盐盐,说明该该溶液中中具有好好氧反硝硝化作用用的细菌菌。如无无红色

14、出出现,再加入入二苯胺胺试剂,若培养养液呈蓝蓝色,则表示示该培养养液中硝硝酸盐未未被转化化,溶液中中无反硝硝化细菌菌;若无色色,则表示示硝酸盐盐和刚生生成的亚亚硝酸盐盐都已原原成氮氧化化物,说明该该溶液中中具有较较强好氧氧反硝化化功能的的细菌。2.3菌菌株的分分离与鉴鉴定从十二里里河的污污泥中筛筛选到220株生生长比较较旺盛，反硝化化能力较较强的好好氧反硝硝化细菌菌，分别别接入含含有硝酸酸钾的LLB培养养基中培培养2-3d通通过格里里斯试剂剂检测菌菌株的反反硝化速速度，先先有无色色粉粉红色玫瑰瑰红色棕色色无无色（滴滴入二苯苯胺仍为为无色）先完成成这个过过程的细细菌反消化化能力较较强，每每隔12

15、2个小时时检测一一次，从从中筛选选8株菌菌做鉴定定。菌株编号号格里斯试试剂检测测结果12h后后24h后后36h后后48h后后1粉红色玫瑰红色色棕色无色2无色粉红色玫瑰红色色棕色3粉红色玫瑰红色色棕色无色4无色无色粉红色玫瑰红色色5无色无色粉红色玫瑰红色色6粉红色玫瑰红色色棕色无色7无色粉红色玫瑰红色色棕色8无色粉红色玫瑰红色色棕色9粉红色玫瑰红色色棕色无色10无色粉红色玫瑰红色色棕色11粉红色玫瑰红色色棕色无色12无色无色粉红色玫瑰红色色13粉红色玫瑰红色色棕色无色14无色粉红色玫瑰红色色棕色15粉红色玫瑰红色色棕色无色16无色粉红色玫瑰红色色棕色17粉红色玫瑰红色色棕色无色18无色粉红色玫瑰

16、红色色棕色19无色无色粉红色玫瑰红色色20无色无色无色粉红色通过上表表分析得得1、33、6、9、111、113、115、117号菌菌株为反反硝化能能力强的的优势菌菌株。将8株菌菌接种后后第2天即产产生大量量气泡,迅速降降解亚硝硝态氮和和总氮的的菌株。6号菌菌株通过过革兰氏氏染色法法在显微微镜下观观察鉴定定该菌株株为革兰兰式阳性性菌株，同时进进行显微微拍照观观察该菌菌的外形形为球形形。2.4菌菌株反硝硝化特性性静置培养养条件下下，菌株株在接种种后的33h进入入了对数数生长期期，在110h菌菌体浓度度达到最最高，随随后进入入生长稳稳定期，在233h左右右进入衰衰亡期。在对数数生长期期，由于于培养基

17、基中含有有丰富的的营养物物质，此此时用于于菌体增增殖的氮氮源主要要是培养养基中的的有机氮氮，而在在生长稳稳定末期期及衰亡亡期，菌菌体基本本不再增增殖，此此时培养养基中的的亚硝态态氮浓度度的变化化应该是是由于反反硝化作作用引起起的。反硝化碳碳源通常常分为三三种类型型:第一类类是易于于生物降降解的有有机物,如实验验中采用用的甲醇醇、乙醇醇、蔗糖糖、葡萄萄糖等;第二类类为可慢慢速生物物降解的的有机物物,如实实验中的的可溶性性淀粉等等;第三类类为细胞胞物质,细菌会会利用细细胞成分分进行内内源反硝硝化。碳碳源的种种类对菌菌株的反反硝化活活性有很很大影响响。一般般来说，在反硝硝化过程程中，易易于生物物降解

18、的的有机物物是最好好的电子子供体，不仅反反硝化速速率快，还能够够提高生生物处理理装置的的能力和和效率，使反硝硝化过程程稳定可可靠1102.5 反硝化化碳源试试验以LB培培养基（KNOO3 11 g、KH22PO44 1 g、FeCCl26H22O 00.055 g、CaCCl27H22O 00.022 g、MgSSO47H22O 11 g、蒸馏水水10000mll、PHH7.007.3为基基础培养养基，分分别加入入不同碳碳源柠檬檬酸钠110g、乙醇110g、醋酸钠钠10gg、葡萄萄糖100g、可可溶性淀淀粉100g、甲甲醇100g作为为唯一碳碳源配制制培养基基。按11接种种量接入入活化并并用无

19、菌菌水洗涤涤干净的的菌液，30静置培培养600h后检检测培养养基中亚亚硝态氮氮的降解解率。2.5.1BBTB平平板筛选选法该方法适适用于对对培养条条件有特特殊营养养要求的的某种好好氧反硝硝化菌的的定向筛筛选。运运用此方方法在好好氧条件件下，利利用平板板的抑菌菌圈大小小，筛选选到对不不同碳源源适应能能力不同同的200株好氧氧反硝化化细菌菌菌株。2.6菌菌株在天天然养殖殖水体中中的反硝硝化特性性取回的阳阳子湖水水样经处处理后,分为两两部分，一份加加入硝酸酸钾（氮氮源）和和葡萄糖糖（碳源源），分分别取550mll分装于于四个锥锥形瓶中中，一组组只加入入硝酸钾钾，取550mll装入一一个锥形形瓶中，1

20、211,330miin灭菌菌处理后后，将不不同浓度度的菌种种（1mml）接接入锥形形瓶中，28恒温培培养。用用格里斯斯试剂定定时检测测颜色变变化。加N、CC只加N无无C加N、CC加N、CC加N、CC投菌浓度度（个/L）检测时间间（h）不投菌3100731007310083100912h无色无色无色粉红色玫瑰红色色16h无色无色无色玫瑰红色色棕色20h24h30h36h2.7投投菌浓度度试验将不同浓浓度的菌菌种投入入阳子湖湖水中，用格里里斯试剂剂定时检检测降解解天然水水中氮的的速度。加N、CC加N、CC加N、CC加N、CC投菌浓度度（个/L）检测时间间（h）不投菌3100731008310091

21、2h16h20h24h30h36h天然水体体中存在在着相当当数量的的土著微微生物，它们和和实验中中人工投投加的菌菌体存在在着相互互竞争的的关系。从工程程实际应应用出发发,为了确保保所投加加的微生生物能在在天然水水体中发发挥应有有的反硝硝化作用用,有必要要从实际际应用的的可操作作性出发发,确定合合适的投投菌量。随着投菌菌量的增增加，亚亚硝态氮氮的降解解率逐渐渐升高；当投菌菌浓度达达到1008个/LL时，菌菌株即可可在水体体中发挥挥高效的的反硝化化作用。说明该该菌株具具有较强强的生存存能力和和环境适适应能力力，在天天然水体体中具有有较强的的竞争力力。产品性能能分析生物脱氮氮以其无无污染、脱氮彻彻底

22、等优优点被认认为是目目前最经经济、有有效、可可行性高高的水体体除氮方方法。但但由于种种种原因因,目前前国内外外市场尚尚无可有有效治理理水体亚亚硝态氮氮污染的的微生态态制剂产产品。分分离得到到的微生生物菌剂剂已在国国内多个个水塘进进行了中中试试验验,均取取得了良良好的脱脱氮效果果。加之芽孢孢杆菌具具有很强强的生命命力和旺旺盛的繁繁殖能力力，能适适应各种种不良的的环境条条件，受受水体酸酸碱度、盐度等等影响较小小，因此此该菌株株具有开开发成微微生态制制剂应用用于受污污染水体体脱氮的的巨大潜潜力。研制结论论及应用用本研究采采用定向向富集（反复筛筛选）的的方法，从污水水处理池池活性污污泥中筛筛选出TTI

23、N去去除率较较高的好好氧反硝硝化细菌菌。该方方法操作作简便、可行，反复筛筛选具有有成本低低、易操作作、达标排排放可靠靠性强且且无二次次污染等等优点。具有较较好的科科学性和和先进行行。不仅仅降低了了工业废废水对水水体环境境的危害害，还可可制得环环保、高高效去除除水体富富营养化化的微生生物菌剂剂，由此此带来的的环境效效益和社社会经济济效益是是非常显显著的。该制备技技术具有有如下特特： eq oac(,1)方法操操作简便便、可行行，反复复筛选具具有成本本低、易操作作、达标排排放可靠靠性强且且无二次次污染等等优点。 eq oac(,2)使硝化化/反硝化化反应在在同一个个反应器器中进行行,可以大大大减少

24、少占地面面积和建建设资金金; eq oac(,3)可以减减少处理理过程中中加入调调节系统统pH值的的化学物物质,降低成成本;好氧反反硝化细细菌在处处理过程程中更容容易控制制。 eq oac(,4)它的发发现打破破了反硝硝化只能能在缺氧氧或厌氧氧条件下下进行的的传统观观点,为新型型生物脱脱氮提供供了新思思路.应用按本方法法筛选到到的好氧氧反硝化化细菌市市场潜力力大，推推广应用用前景广广阔，具具有显著著的经济济效益我我国每年年用于环环境污染染投资约约为8330亿元元，约占占当年GGDP的的1%。尽尽管如此此，水环环境污染染趋势仍仍然没有有得到有有效控制制，每年年由于水水质污染染引起的的损失共共约为5500亿亿元。同时，项目实实施后可可安排社社会闲散散人员就就业，减减轻就业业压力，产生较较好的社社会效益益。利用用活性污污泥筛选选出TIIN 去去除率较较高的好好氧反硝硝化细菌菌，不仅仅能减少少工业废废水对环环境的污污染，而而且能充充分利用用资源，变废为为宝，具具有显著著的环境境效益。附录：BTB培培养基平平板初筛筛复筛过程程中抑菌菌圈筛选的好好氧反硝硝化菌斜斜面保存存的形态态特征图图格里斯试试剂染色色后六号号好氧反反硝化菌菌株油镜镜下显微微观察照照片（1101000）格里斯试试剂的显显色反应应图示参考文献献1