加速衰老小鼠脑组织中的衰老相关基因的表达

1、PAGE PAGE 15加速衰老小鼠脑组织中的衰老相关基因的表达2004-03-18收稿，2004-05-18接受 国家重大基础研究规划项目（973）（No.2000016107）和北京灵泰必成医药技术有限公司资助 This research was funded by the grants from the State Basic Research Development Program “973” (No.2000016107), and Lingtai Bichen Medical Technology Co. Ltd., Beijing通迅作者(Corresponding author

2、). E-mail: qingxuanchen 动物学报 Acta Zoologica Sinica张 冲1,2 程锦雁1王锦刚3 陈清轩1* 1中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100080；2国科科学院研研究生院院，北京京10000399；3. 北北京灵泰泰必成医医药技术术有限责责任公司司北京京11000086.摘 要 从分子子水平上上研究衰衰老对大大脑的影影响有助助于揭示示机体衰衰老的分分子机理理，也有有助于揭揭示衰老老相关性性脑功能能异常的的发生过过程。本本研究应应用DDDRTPCRR方法研研究衰老老相关基基因在SSAM（Sennesccencce-AAcceelerrateed

3、MMousse）小小鼠脑组组织中表表达的变变化情况况。在SSAMRR1TAA、SAAMP88/Taa、SAAMP110/TTa三个个品系中中，通过过比较不不同鼠龄龄SAMMP100/Taa（2、4、112、118月龄龄）的基基因表达达情况，发现在在4月龄龄和122月龄分分别有一一个差异异表达片片段；对对不同鼠鼠龄的SSAMPP8/TTa（22、4、11月月龄）经经差显比比较, 发现在在2月龄龄和111月龄各各有一差差异表达达片段。在不同同品系的的比较中中发现了了16个个差异性性片段，分别属属于SAAMP110/TTa(33个)、SAMMP8/Ta(6个)和SAAMR11TA（7个）。测序序结果

4、经经检索显显示，它它们分别别与下列列基因转转录产物物同源：热休克克识别蛋蛋白770、AATP依依赖性线线粒体RRNA螺螺旋酶、Dleeu mmRNAA、小鼠鼠X染色色体RPP23-3344C4克克隆DNNA序列列、还原原型辅酶酶Q-细细胞色素素c还原原酶复合合物7.2KDD亚单位位、600S核糖糖体蛋白白L211、FIIS、苯苯基烷基基胺钙离离子拮抗抗物结合合蛋白、岩藻糖糖基转移移酶99、胶质质细胞源源性神经经营养因因子家族族受体1、内内切核酸酸酶/逆逆转录酶酶、PEER1蛋蛋白相关关超级融融原核蛋蛋白、中中心体蛋蛋白CGG-NAAP、转转铁蛋白白重链基基因、巢巢蛋白-2基因因、DNNA依赖赖

5、性蛋白白激酶催催化亚单单位基因因prkkdc 动物物学报 50（4） - ，220044。关键词 加速速衰老小小鼠 衰老相相关基因因表达 逆转转录差异异显示聚聚合酶链链式反应应 脑脑组织Exprresssionns oof ageeingg-asssocciatted genne iin ccereebraal ttisssue of sennesccencce-aacceelerrateed mmousse*Zhanng CChonng1.2 Cheeng Jinn-Yaan1 WWangg Jiin-GGangg3 Chhen Qinng-XXuann1* 1. IInsttituute

6、of Gennetiics andd Deevellopmmenttal Bioologgy, Thee Chhineese Acaademmy oof SScieencees, Beiijinng 11000080, Chhinaa2. GGradduatte SSchoool of Chiinesse Acaademmy oof SScieencees, Beeijiing 10000399, CChinna3. LLinggtaii Biicheen MMediicall Teechnnoloogy Co. Lttd. Beiijinng, 10000866, CChinnaAbasst

7、raact A bbettter unddersstanndinng oof tthe mollecuularr efffeccts of ageeingg inn thhe bbraiin mmay hellp tto rreveeal impporttantt asspeccts of orgganiismaal aageiing, as wwelll ass prroceessees tthatt leead to ageeingg-reelatted braain dyssfunnctiion. Inn thhis stuudy, thhe aageiing-speeciffic ex

8、ppresssioon ggenees oof tthe murrinee ceerebbrumm weere invvesttigaatedd byy emmplooyinng ddifffereentiial-dissplaay rreveersee trransscriiptiion pollymeerasse cchaiin rreacctioon (DDRRT-PPCR) inn thhreee seenesscennce-accceleeratted mouuse (SAAM) strrainns: SAMMP8/Ta, SAAMP110/TTa aand SAMMR1TTA. T

9、hrrouggh ccomppareed ggenee exxpreessiion proofille aamonng tthe agee 188, 112, 4, andd 2 monnth of thee SAAMP110/TTa sstraain, twwo ddifffereentiial fraagmeentss haave beeen ffounnd, whiich bellongg too 4 andd 12 mmontth iindiividduallly; annd iin aage 11, 4 andd 2 monnth of thee SAAMP88/Taa sttrai

10、in, twoo frragmmentts hhavee beeen fouund, whhichh beelonng tto 111 aand 2 mmontth rresppecttiveely. Annd ccomppareed ggenee exxpreessiion proofille iin ddifffereent strrainns mmicee, 116 ffraggmennts havve bbeenn deetecctedd, 33, 66 annd 77 off thhem bellongg too SAAMP110/TTa, SAMMP8/Ta andd SAAMR1

11、1TA resspecctivvelyy. SSequuencce rresuultss inndiccatee thhat thoose fraagmeentss arre hhomoologgouss wiith heaat sshocck pprotteinn coognaate prooteiin 770，ATPP-deepenndennt mmitoochoondrriall RNNA hheliicasse, Dleeu2 mRNNA, Mouuse DNAA seequeencee frrom cloone RP223-3334CC3 oon cchroomossomee X,

12、ubbiquuinool-ccytoochrromee c redducttasee coompllex (7.2 kkD), 600S rriboosommal prooteiin LL21, FIIS, pheenyllalkkylaaminne CCa2+ anntaggoniist (emmopaamill) bbinddingg prroteein, fuucossylttrannsfeerasse 99, ggliaal ccelll liine derriveed nneurrotrrophhic facctorr faamilly rreceeptoor aalphha 11,

13、 eendoonuccleaase/revversse ttrannscrripttasee, PPER11 innterracttingg prroteein of thee suupraachiiamaaticc nuucleeus hommoloog, cenntroosommal prooteiin CCG-NNAP, feerriitinn heeavyy chhainn geene, NIID-22 geene, annd pprkddc ggenee foor DDNA-deppenddentt prroteein kinnasee caatallytiic ssubuunitt

14、 Actta ZZoollogiica Sinnicaa 500(4): - , 20004. Key worrds Sennesccencce-AAcceelerrateed MMousse, Aggeinng-aassoociaatedd geene exppresssioon, Difffereentiial dissplaay rreveersee trransscriiptiion pollymeerasse cchaiin rreacctioon; Cereebraal TTisssue衰老是指指机体达达到其最最大繁殖殖能力后后生理功功能的进进行性降降低(RRoy et al.,

15、119966),是是一个自自发而又又与早期期的程序序化发育育相对应应的过程程。机体体的寿命命取决于于许多因因素，其其中包括括遗传因因素（FFincch eet aal.,19997; Pucca eet aal., 20001）、激素素和生长长因子信信号(FFlurrkeyy ett all., 20001;CCoscchigganoo ett all., 20000)、体重(Piaantaanellli et al., 220011)、体体脂含量量和环境境因素(Cosschiiganno eet aal., 20000; Maasorro, 20000)等等。进化化理论认认为衰老老并非是是机

16、体的的适应性性特征，而是随随着时间间推移机机体许多多功能注注定丧失失的结果果。医疗疗记录也也给我们们这样的的印象：衰老是是许多独独立导致致疾病并并最终导导致死亡亡的退行行性变化化过程的的集合(Hekkimii ett all., 20003)。模式动物物加速衰衰老小鼠鼠（Seenesscennce-Accceleeratted Mouuse，SAMM）是由由一系列列相关的的纯系所所组成，包括99个短寿寿的加速速衰老品品系和33个寿命命较长的的正常衰衰老的品品系（TTakeeda et al.,19981，19991）。SAMMP系小小鼠显示示系特异异性衰老老相关的的病理表表型，包包括出现现衰老

17、表表征提前前和寿命命缩短。本研究究应用了了三个品品系小鼠鼠作为研研究对象象，以期期发现衰衰老相关关表达的的基因。其中，SAMMP8/Ta与与SAMMP100/Taa表现为为短寿及及与鼠龄龄相关的的学习认认知损害害、情感感紊乱、昼夜节节律异常常，SAAMP88/Taa还表现现免疫损损害；SSAMRR1TAA则为正正常寿命命且无衰衰老相关关病理表表型的对对照系（Takkedaa，19999）。SAM模模式小鼠鼠显示出出的加速速衰老的的病理表表型说明明：衰老老至少从从一定意意义上来来说是受受遗传控控制的。迄今为为止，SSAM小小鼠己被被广泛用用于衰老老相关性性疾病的的研究，但很少少涉及导导致其寿寿命

18、缩短短的分子子机理的的研究（Zhaang et al., 220022; KKumaar eet aal., 20000）。因此此，我们们应用DDDRTT-PCCR方法法对不同同鼠龄和和不同品品系的加加速衰老老小鼠(SAMM)脑组组织进行行了比较较研究，以期找找出与衰衰老相关关的基因因片段，进而为为进一步步研究衰衰老的分分子机制制打下基基础。1 材料料和方法法1.1 材料1.1.1 实实验动物物及饲养养条件 SSAMRR1TAA、SAAMP88/Taa、SAAMP110/TTa系小小鼠购自自日本京京都大学学，在本本所实验验动物中中心按普普通级进进行饲养养，122小时明明暗光周周期，自自由饮水水

19、及采食食。实验验中动物物使用饲饲料为购购自军事事医学科科学院实实验动物物中心饲饲料厂的的商业化化小鼠饲饲料。1.1.2 实实验用试试剂 RNAA小量提提取试剂剂盒(QQiaggen)、 QQIAsshreeddeerTMM (QQiaggen)、 PPCR 管（Axxygeen）、M-MMuLVV逆转录录酶(BBiollabssIncc.)、dNTTP (proomgaa)、TTaq DNAA聚合酶酶 (PPrommga)、-32p-dCTTP（亚亚辉）、无RNNA酶的的DNA酶酶(Prromgga)、RNAA酶抑制制剂(PPrommga)、尿素素（Prromgga）、糖原(SSigmma)、

20、琼脂糖糖（Biioweest）、Wiizarrd PCRR Prreps DDNA纯纯化系统统（Prromgga）、pGEEM-T Eassy载体体(Prromgga)、氨苄青青霉素(siggma)、IPPTG(Proomgaa)、XX-Gaal (Prromgga)、 DHH5感感受态菌菌（天威时时代）、UlttraPPureeTM 质粒粒纯化试试剂盒（赛百盛盛）、XX光胶片片(Fuuji Phooto Fillm CCo.LLtd.)、BDD MaaratthonnTM ccDNAA 扩增增试剂盒盒(BDD Biioscciennce Cloonteech)、 PPROTTRANN 硝酸酸

21、纤维素素转印膜膜(Scchleeichher&Schhuelll)、 预杂杂交及杂杂交液(上海生生物工程程技术服服务有限限公司)、 随随机引物物DNAA标记试试剂盒(TaKKaRaa Biioteechnnoloogy Co.Ltdd.)。 1.1.3 实实验用引引物:由由赛百盛盛公司合合成，序序列如下下：A11: 55-AACAGGA GGCACCA； APGG: 55-AAAGCCT TTTTTTT TTTTTTT TTG；AAPC: 5-AAAGCTT TTTTTTT TTTTTTT TCC；APPA: 5-AAGGCT TTTTTT TTTTTT TA。1.2 方法1.2.1 总RNN

22、A提取取 实验验用雄性性小鼠断断颈处死死，撕去去头部皮皮肤，打打开头盖盖骨，取取出脑组组织。切切取大脑脑左前部部1/22约300mg,放入玻玻璃研磨磨器中，加入裂裂解液后后研磨，按RNNeassy mminii Kiit操作作方法提提取总RRNA。经无RRNA酶酶的DNNA酶处处理后备备用。1.2.2 RRNA逆逆转录 在PCCR管中中加入22l总RRNA（约1g）、10XX RTT buuffeer 44l、2.55mM dNTTP 11.6l、33引物 2l、RRNA酶酶抑制剂剂(400iu/l) 0.5ll、加水水至199l。665 5 miin，44210 minn、加入入M-MMuL

23、VV 逆转转录酶11l (2000iuu),337 500 miin、775 5 minn。 1.2.3 逆转转录产物物的PCCR扩增增 反应应体系为为逆转录录产物22l、110X Buffferr 2l、25mmM MMgCll2 2l 、2.55mM dNTTP 11.6l、55引物（2MM）2ll、3引物(22M) 2l、Taqq DNNA聚合合酶(55iu/l) 0.4ll、-322P-dCCTP (100Cii/ll) 0.5ll、加水水至200l。PPCR反反应参数数为94410 minn；9441 mmin,402 mmin，721 mmin，40个个循环；725 mmin。1.

24、2.4 6%尿尿素变性性聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳及差异异条带的的回收再再扩增 将11.2.3扩增增产物经经6%尿尿素变性性聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳后，XX光片压压片，20曝光772小时时后显影影，找出出差异性性条带。从凝胶胶上切取取差异条条带，加加入1000ll双蒸水水，室温温浸泡110 mmin，煮沸115 mmin。离心取取上清，加入33M乙酸酸钠（PPH5.2）110ll，糖原原（200mg/ml）2.55l, 无水水乙醇4450l，20过夜。4离心110 mmin，沉淀用用冰预冷冷的855%乙醇醇洗涤后后溶于110ll双蒸水水中。再再扩增反反应体系系为回收收产物44l、110 Buuf

25、feer 44l、25mmM MggCl22 4l 、2.55mM dNTTP 33.2l、55引物（2MM）4l、33引物(22M) 4l、Taqq DNNA聚合合酶(55iu/l) 0.8ll、加水水至400l。PPCR反反应参数数为944 100 miin；994 1 minn,400 2 minn，722 1 minn，200个循环环；722 5 minn；944 100 miin；994 1 minn,400 2 minn，722 1 minn，200个循环环；722 5 minn。1.2.5 再再扩增产产物的鉴鉴定及纯纯化 取取部分再再扩增产产物用11.2%琼脂糖糖凝胶电电泳鉴定定

26、，其余余部分用用Wizzardd PCCR PPrepps DDNA 纯化系系统进行行纯化。1.2.6 纯纯化产物物的连接接及转化化 将纯纯化产物物连入ppGEMM-T Eassy 载载体。转转化感受受态DHH5大肠杆杆菌。加加SOCC培养基基37，1550转/ miin，培培养1.5小时时。LBB/ampp/IPPTG/X-GGal平平板涂布布，377培养116小时时。挑取取单个白白色菌落落，接种种LB/ampp培养基基37,1550转/ miin培养养过夜。1.2.7 质粒粒提取及及鉴定 取单菌菌落过夜夜培养物物按UlltraaPurreTMM质粒DDNA小小量提取取试剂盒盒使用说说明提取

27、取质粒DDNA。进行PPCR扩扩增，11.2%琼脂糖糖凝胶电电泳鉴定定。PCCR反应应体系为为提取质质粒2l、110X BBufffer 2ll、25mmM MMgCll2 2l 、2.55mM dNTTP 11.6l、55引物（2MM）2ll、3引物(22M) 2l、Taqq DNNA聚合合酶(55iu/l) 0.4ll、加水水至200l。PPCR反反应参数数为94410 minn；9441 mmin,402 mmin，721 mmin，30个个循环；725 mmin。1.2.8 测序序及GeenBaank检检索分析析 测序序交由上上海生工工和上海海博亚进进行。测测序结果果通过GGenBBa

28、nkk检索进进行同源源性比较较分析。1.2.9 差差异表达达片段的的Virrtuaal NNorttherrn BBlott验证 总RNNA按BBD MMaraathoonTMM cDDNA 扩增试试剂盒使使用说明明进行逆逆转录并并扩增后后电泳。按Saambrrookk和Russselll(220011)介绍绍的方法法经转膜膜后进行行杂交。2 结 果使用DDDRT-PCRR方法，我们比比较了同同品系不不同鼠龄龄SAMM小鼠（SAMMP8/Ta 鼠龄分分别为 2, 3.55, 111个月月； SSAMPP10/Ta鼠鼠龄分别别为2, 4, 122, 118.55个月；SAMMR1TTA鼠龄龄分别

29、为为2, 4, 12, 188个月）脑组织织的基因因表达情情况，找找到了44个差异异表达片片段，分分别属于于4月龄龄与122月龄的的SAMMP100/Taa 和22月龄与与11月月龄的SSAMPP8/TTa。对对不同品品系SAAM小鼠鼠脑组织织的基因因表达情情况比较较共发现现了422个差异异性条带带。图11,2显显示部分分DDRRT-PPCR结结果。图1.不不同鼠龄龄SAMMP100/Taa脑组织织DDRRT-PPCR结结果Fig 1. Ressultts oof tthe DDRRT-PPCR forr thhe ccereeball tiissuues off diiffeerennt a

30、age SAMMP100/Taa 箭头所示示为差异异性表达达条带。图下数数字表示示如下：1、22为2月月龄SAAMP110/TTa，33、4为为4月龄龄SAMMP100/Taa，5、6为112月龄龄 SAAMP110/TTa，77、8为为18月月龄 SSAMPP10/Ta。The arrrowhheadd shhowss thhe ddifffereentiial dissplaay bbandds. Thee nuumbeers bellow thee fiigurre ppressentt ass foolloows: 1 andd 2 sammplees ffromm 2 monnth

31、SAMMP100/Taa, 3 aand 4 ssamppless frrom 4 mmontth SSAMPP10/Ta, 55 annd 66 samppless frrom 12 monnth SAMMP100/Taa, aand 7annd 88 Saamplles froom 118 mmontth SSAMPP10/Ta.图2 不不同品系系SAMM小鼠脑脑组织DDDRTT-PCCR结果果Fig. 2 Reesullts of thee DDDRT-PCRR foor ccereeball tiissuue oof ddifffereent SAMM sttraiins箭头所示示为差

32、异异性表达达条带。图下数数字表示示：1、2为22月龄SSAMPP8/TTa，33、4为为4月龄龄SAMMP8/Ta，5、66为111月龄SSAMPP8/TTa，77、8为为2月龄龄SAMMR1TTA，99、100为4月月龄 SSAMRR1TAA，111、122为111.5月月龄SAAMR11TA，13、14为为18月月龄SAAMR11TA。The arrrowhheadd shhowss thhe ddifffereentiial dissplaay bbandds. Thee nuumbeers bellow thee fiigurre ppressentt thhe ssamppless

33、frrom as folllowws: 1 aand 2 SSAMPP8/TTa oof 22 moonthh, 33 annd 44 SAAMP88/Taa off 4 monnth, 5 andd 6 SAMMP8/Ta of 11 monnth, 7 andd 8 SAMMR1TTA oof 22 moonthh, 9 aand 10 SAMMR1TTA oof 44 moonthh, 111 aand 12 SAMMR1TTA oof 111.55 moonthh, aand 13 andd 144 SAAMR11TA of 18 monnth.在所获得得的这些些条带中中，200个己成

34、成功再扩扩增，并并经连接接转化后后进行了了测序分分析。经经NCBBI-BBLASST同源源性检索索，其结结果见表表1。表1 差差异表达达片段NNCBII-BLLASTT检索结结果Tablle 11 FFeatturees oof SSequuencced Cloone andd Reesullts of BLAAST Seaarchh序号 大大小(bbp)* 同源序序列(BBLASST) 登陆号号 同源源性 比较大大小No. Siize (bpp) Seequeencee hoomollogyy(BLLASTT) Acccesssioon NNo. ideentiity/% Oveerlaap

35、1*1200 bpp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)热热休克识识别蛋白白70 mRNNABC00067722.199%1044Mus musscullus heaat sshocck ccognnatee prroteein 70 mRNNA21332 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) mRNNA，类类似于酿酿洒酵母母BC0049779694%1422(S.ccereevissiaee)的varr1, 3抑制制蛋白-1Mus musscullus，simmilaar tto ssupppresssorr off vaar1, 3-likke 11(S.ccereev

36、issiaee) mmRNAA31666 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) X染色色体克隆隆RP223-3334CC3 DDNA AL66720057.81000%1322MMus musscullus DNAA seequeencee frrom cloone RP223-3334CC3 oonchroomossomee X41881 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) Dlleu22 mRRNAAF3380442398%1911MMus musscullus Dleeu2 mRNNA7 2566 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) 还原型型辅酶Q

37、Q-细胞胞色素cc还原酶酶BC00245518.199%2633复合物77.2kkD亚单单位mRRNAMMus musscullus mRNNA, Simmilaar tto uubiqquinnol-cyttochhromme ccrreduuctaase commpleex (7.22 kDD)12 2277 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) 60SS核糖体体蛋白LL21mmRNAAXM_19334088.199%2355MMus musscullus mRNNA, simmilaar tto 660S ribbosoomall prroteein L21113 1988

38、bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) FIIS ccDNAAAK00038875.11000%2066MMus musscullus siimillar to FISS cDDNA14 1988 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) FIIS ccDNAAAK00038875.11000%2066MMus musscullus simmilaar tto FFIS cDNNA16 1355 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)苯苯基烷胺胺拮抗物物(emmopaamill) CCa2+BC00047703.11000%1433离子结合合蛋白mmRNAA Mus

39、 musscullus pheenyllalkkyl-amiine Ca22+ aantaagonnistt (emoopammil) binndinng pprotteinn mRRNA 19 1322 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)岩岩藻糖基基转移酶酶cDNNAAK00476650.194%1366Mus musscullus fuccosyyl-ttrannsfeerasse 99 cDDNA20 1033 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)胶胶质细胞胞源性神神经营养养因子mmRNAABC00402251.11000% 73MMus musscullus,

40、 Siimillar to gliial celll llinee deerivvedneurrotrrophhic facctorr faamillyreecepptorr allphaa 1 mRNNA24 2555 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) 还原型型辅酶QQ-细胞胞色素cc还原酶酶BC00245518.199%2633复合物77.2kkD亚单单位mRRNAMus musscullus mRNNA, Simmilaar tto uubiqquinnol-cyttochhromme ccreduuctaase commpleex (7.2 kkD)25 1122 bp

41、小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)核核酸内切切酶/逆逆转录酶酶mRNNAXM_20771188.294%1211Mus musscullus mRNNA, simmilaar tto eendoonuccle- asse/rreveersee traansccripptasse27 1111 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) cDNNA,产产物与大大家鼠(RatttussAK00509919.197%1222norvvegiicuss)上视视交叉核核的PEER1相相互作用用蛋白同同源Mus musscullus, PEER1 intteraactiing proote

42、iin oof tthesuprrachhiammatiic nnuclleuss hommoloog Ratttuss noorveegiccus29 1088 bp大家鼠鼠(Raattuus norrveggicuus)中中心体蛋蛋白CGG-NAAP mmRNAAAB00713391.191%1166 Ratttuss noorveegiccus mRNNA ffor cenntroosommal prooteiin CCG-NNAP32 98 bp 小家家鼠(MMus musscullus)60SS核糖体体蛋白LL21mmRNAAXM_12225011.11000%1055MMus mu

43、sscullus mRNNA simmilaar tto 60SS riibossomaal prooteiin LL2133 98 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)60SS核糖体体蛋白LL21mmRNAAXM_12225011.199%1055MMus musscullus mRNNA ssimiilarr too 60SS riibossomaal prooteiin LL2136 1777 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)铁铁蛋白重重链基因因cDNNAM6001700.11000%1844MMus musscullus ferrrittin heaavy

44、chaain genne ccDNAA 40 1844 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)巢巢蛋白-2基因因外元119-221AJ44285512.199%1955Mus musscullus parrtiaal NNID-2 ggenee foor nnidoogenn-2, exxonss 199-21141 1455 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)DDNA依依赖性蛋蛋白激酶酶催化亚亚单AB00307754.193%48位PRKKDC cDNNAMus musscullus prkkdc genne ffor DNAA-deepenndennt pprott

45、einn kinaase cattalyyticc suubunnit * 大小小不包含含引物序序列。 * 片片段来源源. 同系不不同鼠龄龄比较: 11： 来来自 112月龄龄SAMMP100/Taa.。2：来自自11月龄龄 SAAMP88/Taa。3：来自自2月龄 SSAMPP8/TTa。 4：来自自4月龄 SSAMPP10/Ta。 品品系间比比较：77：来自自SAMMR1TTA。12：来自自SAMMP100/Taa。13：来自自SAMMR1TTA。14：来自自SAMMP8/Ta。 166：来自自SAMMR1TTA。19：来自自SAMMP8/Ta。 200：来自自SAMMP100/Taa。2

46、4：来自自 SAAMP88/Taa。 255：来自自SAMMP100/Taa。27：来自自SAMMP8/Ta。29：来自自 SAAMP88/Taa。 322：来自自SAMMR1TTA。33：来自自SAMMP8/Ta。36：来自自SAMMR1TTA。40：来自自SAMMR1TTA。 41：来自自SAMMR1TTA。*Thee prrimeer ssequuencces aree noot iinclludeed iin tthe sizze.*Soourcce oof tthe fraagmeentss. Ageeingg sppeciificc exxpreessiion fraagmeent

47、ss: NNo.11 SAAMP110/TTa oof 112 mmontth, No.2 SSAMPP8/TTa oof 111 mmontth,No.33 SAAMP88/Taa off 2 monnth, Noo. 44 SAAMP110/TTa oof 44 moonthh. SStraain speeciffic exppresssioon ffraggmennts: Noo. 77 SAAMR11TA, Noo. 112 SSAMPP10/Ta, Noo.133 SAAMR11TA, Noo.144 SAAMP88/Taa, NNo.116 SSAMRR1TAA, NNo. 19

48、SAMMP8/Ta, Noo. 220 SSAMPP10/Ta, Noo. 224 SSAMPP8/TTa, No. 255 SAAMP110/TTa, No. 277 SAAMP88/Taa, NNo. 29 SAMMP8/Ta, Noo. 332 SSAMRR1TAA, NNo. 33 SAMMP8/Ta, Noo.366 SAAMR11TA, Noo.400 SAAMR11TA, Noo.411 SAAMR11TA. 为为验证所所得的这这些差异异片段表表达的特特异性，我们进进行了VVirttuall Noorthhernn Bllot分分析(HHungg ett all., 19999)

49、。部分结结果见图图3。图3 部分片片段的VVirttuall Noorthhernn Bllot验验证结果果Fig33. VVirttuall noorthhernn bllot ressultts oof pparttiall frragmmenttsM为DLL20000maarkeer，PP10来来自SAAMP110，RR1来自自SAMMR1，P8来来自SAAMP88。M iss DLL20000 MMarkker. PP10 Sammplees ccomee frrom SAMMP100/Taa. R1 Sammplees ccomee frrom SAMMR1TTA. P88 Saam

50、plles comme ffromm SAAMP88/Taa.3 讨论论 应用DDDRTT-PCCR方法法对不同同鼠龄和和不同品品系的SSAM小小鼠脑组组织基因因表达情情况研究究，我们们从中找找出了442个差差异性表表达条带带，并从从中鉴定定出了220个基基因片段段。其中中4个, 对同同系不同同龄,为为鼠龄特特异性表表达；另另外166个,对对异系而而言,为为系特异异性表达达。 4个鼠鼠龄特异异性表达达基因分分别与下下列基因因同源：热休克克识别蛋蛋白-770、AATP依依赖性线线粒体RRNA螺螺旋酶、Dleeu2 mRNNA、小小鼠X染染色体RRP233-3334C33克隆DDNA序序列。热热休

51、克识识别蛋白白系统是是应激诱诱导表达达并在基基础条件件下组成成型表达达的细胞胞防卫和和维持其其完整性性所必需需。是机机体抵抗抗内源性性及外源源性损害害应激、细胞生生存和损损害修复复的关键键因子(Sotti eet aal., 20000)。Heeydaari et al.(19994)研究显显示，老老年动物物的诱导导性热休休克蛋白白表达较较年青动动物降低低50%。其降降低主要要发生在在转录水水平，由由于热休休克蛋白白的转录录因子缺缺乏所致致。老年年动物热热休克反反应性的的降低可可能是衰衰老过程程中有害害蛋白积积聚和细细胞异常常死亡的的重要因因素。轻轻度的重重复性热热休克反反应对细细胞和机机体具

52、有有抗衰老老激素样样作用(Verrbekke eet aal.,20001)。Maiielllo eet aal. (19998)研究认认为，在在年青和和年老动动物中，非诱导导基础表表达HSSP的机机制是不不同的。我们的的研究结结果显示示，在112月龄龄的SAAMP110/TTa小鼠鼠脑组织织中，HHSC770的表表达水平平较其它它几个鼠鼠年龄的的表达水水平高。推测其其可能与与衰老过过程中异异常蛋白白在细胞胞中积聚聚从而诱诱导HSSP表达达，导致致HSPP转录增增加。但但随着鼠鼠龄进一一步增长长，其表表达的水水平因其其可诱导导性降低低而又逐逐渐下降降。 线线粒体基基因表达达在很大大程度上上受核

53、基基因组所所控制。在酵母母中，核核基因VVAR11产物是是线粒体体37ss核糖体体亚单位位装配所所必须。SUVV311编码AATP-依赖的的线粒体体RNAA螺旋酶酶调控VVAR11 RNNA转录录和转录录后代谢谢，进而而提高细细胞色素素b和CCOX I mmRNAA 的转转录效率率(Coonraad-WWebbb ett all.,119900; SSteppienn ett all.,119922)。细细胞色素素b和COXX是线粒粒体电子子传递链链的关键键组成部部分，在在衰老过过程中SSUV33-1可可能通过过影响电电子传递递链相关关的自由由基的产产生而发发挥作用用。 CCalllejaa

54、ett all. (19993)研研究显示示，在果果蝇中线线粒体转转录水平平随年龄龄增长而而降低。本研究究发现，SUVV3-11 mRRNA在在11月月龄的SSAMPP8/TTa表达达水平较较2月龄龄和4月月龄高，显示其其可能是是老龄动动物维持持线粒体体转录水水平所必必需的。FIS是是一个多多向性代代谢调节节物,属于小小分子DDNA结结合蛋白白成员。FISS降低DDNA螺螺旋酶的的活性并并全面抵抵消DNNA超螺螺旋密度度的增加加。Muuskhheliishvvilii ett all. (20003)体体外研究究结果显显示，FFIS结结合于超超螺旋DDNA导导致分支支结构形形成并使使顶端环环状

55、结构构增加。 而结合合于稳定定的RNNA启动动子上游游时FIIS在拓拓扑学上上起着稳稳定局部部高水平平超螺旋旋密度的的作用，是启起起动子活活性所必必需。并并认为FFIS通通过调节节整体与与局部负负超螺旋旋的自由由能至特特异性基基因表达达位点起起作用。在原核核生物中中，FIIS参与与Hinn介导的的位点特特异性重重组的核核蛋白体体的装配配(Paaulll ett all.,119944), rRNNA和ttRNAA的转录录激活，抑制其其自身的的合成及及orii-C 起始的的DNAA复制(Finnkell ett all.,119922)。在在植物，FISS是一个个印迹基基因，参参与种子子发育过过

56、程中细细胞生长长和增殖殖的调控控(Baarouux eet aal., 20002)，FIIS通过过染色质质重塑抑抑制下游游种子发发育基因因表达(Chaaudhhuryy ett all., 20001)。在哺乳乳动物体体，FIIS与高高迁移组组分蛋白白HMGG1和HMGG2相互互作用促促进DNNA可塑塑性(PPaulll eet aal., 19993)。本研研究结果果显示，其在SSAMPP10/Ta的的表达明明显降低低，显示示其在衰衰老过程程中也起起着重要要作用。 苯苯基烷基基胺Caa2+拮抗抗物结合合蛋白是是哺乳动动物内质质网定位位膜蛋白白，催化化8-甾醇转转化为7-甾甾醇，8-7甾醇醇

57、异构酶酶是真核核生物甾甾醇合成成途径中中的必需需酶(SSilvve eet aal., 19996)。显性性X染色色体连锁锁的斑状状软骨发发育异常常(CDDPX22)是由由编码8, 7甾甾醇异构构酶的eemoppamiil结合合蛋白(EBPP)基因因突变所所致。CCDPXX2患者者显示皮皮肤损害害包括：皮肤线线状或螺螺旋状萎萎缩、色色素沉着着异常、条纹状状角化过过度、毛毛发粗糙糙无光、秃顶、白内障障。骨骼骼异常包包括：身身材短小小、四肢肢肢根性性缩短、骨骺点点状损害害和颅面面骨缺陷陷(Deerryy ett all.,119999)。SSAMPP小鼠的的病理表表型与其其中某些些症状相相一致，如

58、被毛毛稀少、粗糙无无光、脊脊柱前凸凸、白内内障、皮皮肤粗糙糙和不同同程度的的皮肤损损害(TTakeeda et al.,19981)。本研研究显示示苯基烷烷基胺CCa2+拮抗物物(Emmopaamill)结合合蛋白在在SAMMP较SSAMRR低，提提示其与与SAMMP的病病理表型型相关，可能也也是其寿寿命缩短短的因素素之一。 岩藻糖基基转移酶酶-9(FUTT9)优优先在聚聚乳糖胺胺的的远远端GllcNAAc残基基进行岩岩藻糖基基化而在在Lewwis x糖类类表位抗抗原LLe(xx);CCD155;阶段段特异性性胚胎抗抗原(SSSEAA-1)合成成中起重重要作用用(Niishiiharra ee

59、t aal.,19999)。Maii ett all. (19992, 19999)认认为，中中央听觉觉系统CCD155的瞬时时表达与与其功能能状态的的可塑性性相关，其起始始表达预预示着形形成不稳稳定性突突触接触触的出现现。Oggisoo等(119955)研究究显示，含Leewiss x的的新乳糖糖系列糖糖脂在老老年性白白内障进进程中积积聚。CCD155水平反反映了发发育过程程中视网网膜膝膝状弯曲曲的相互互作用程程度的差差异，CCD155在神经经纤维网网的表达达在建立立成熟的的经验依依赖性相相互联系系阶段的的消失可可能预示示着与学学习记忆忆相关的的可塑性性的丧失失。本研研究显示示FUTT 9在

60、在SAMMR1TTA 的的表达低低于SAAMP88/Taa,显示示其与SSAMPP8/TTa的老老年性病病理表型型-学习习和识别别功能障障碍相关关。胶质细胞胞源性神神经营养养因子家家族受体体1 (GGFR1),是一种种胶质细细胞源性性神经营营养因子子（GDDNF）的糖基基磷脂酰酰肌醇锚锚受体，在副神神经和发发育中的的外周感感觉神经经及交感感神经元元表达为为膜结合合型和分分泌型。GDNNF是多多种类型型神经元元的有效效存活因因子，GGDNFF与高亲亲和力GGFR1结合合。该受受体在脑脑的不同同区域表表达，包包括脑海海马和齿齿状回。Sarrabii等(220000)对GGFR-1表表达分布布研究后