附录B测定PLATINUMTMpfxDNA聚合酶的保真度

1、 第十一章PCR扩增产物表达的快速方法使用DirectionalTOPO表达试剂盒把克隆基因转入到表达载体，将节省你大量时间。这些试剂盒具有快速，高效的特点，DirectionalTOPO克隆技术结合高效的pET和pcDNA3.1载体中，使你从PCR中立即得到表达结果。?成熟的技术DirectionalTOPO克隆技术将平整末端的单向克隆的PCR产物转入pET或pcDNA3.1载体，使用DirectionalTOPO克隆表达试剂盒将使你：节省时间一一TOPO克隆PCR产物只需要5分钟。得到高质量的克隆结果大于90%的重组克隆表达出正确的排列。完成高水平表达载体携带强大的表达启动子。?节省工作时

2、间DirectionalTOPO克隆试剂盒用拓朴异构酶I代替了连接酶，传统的限制性内切酶过夜孵育的克隆方法被只需5分钟的拓朴异构酶介质连接的方法代替，这样大缩短了你的工作时间。pET和pcDNA3.1试剂盒和DirectionalTOPO试剂盒提供了线性的和无需介质就具有活性的拓朴异构酶I的载体。DirectionalTOPO试剂盒的全部克隆程序，只有三步并且90%以上的重组克隆表达出正确的排列。省略了克隆和筛选的步骤，大大加快了实验步伐。附录B测定PLATINUMTMpfxDNAg合酶的保真度PLATINUM?pfxDNA聚合酶是一种高保真DNA聚合酶，特别适用于克隆和突变。PLATINUM

3、?pfxDNA聚合酶的保真性有两种分析来确定，rpsL保真度分析和LacZ保真度分析，并与其它聚合酶相比较。当测定DNA聚合酶的保真度时，保真度数据的变化可能来自不同的分析过程，由于目标中的潜在的突变热点。当评价保真度数据时，保持相似的不是绝对数值而是相对比的酶之间的相对关系。这篇文章用两种分析来评价几种酶的保真度。PLATINUM?pfxDNA聚合酶具有3到5的校正外切酶活性。与其它TaqDNA聚合酶相比具有最低的错误率。方法：rpsL保真度分析：pMOL21质粒DNA（4kb）,包含氨苄青霉素抗性（Apr）和rpsL基因，用ScaI线性化（图1）。按照制造商的使用说明。进行50微升体积的标

4、准PCR反应，使用2单位TaqDNA聚合酶或PLATINUM?TaqDNA聚合酶，2.5单位pfuDNA聚合酶或pfuTurbo?DNA聚合酶，和1.25单位PLATINUM?pfxDNA聚合酶，使用生物素标记引物AAAAACGCGTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTAC-3（正向序列）和AAAAACGCGTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAG-3（反向序列）。使用1ng模板DNA时进行25个循环，10ng时进行15个PCR循环。PCR反应条件，94C,2分钟，接94C15秒，58C30秒，68C5分钟的25次或15次循环。百分之二十的反应物用于0.5XBE的0.8%琼脂

5、糖凝胶电泳，并用0.25卩g/仃的勺溴化乙锭溶液染色。CclloctbneWpurlVvPCK工Pt塞.忖QnL日(AmpbeVIVIH)ffelMlB-9PlataonLB(Amfkldlllln*Strv口umir毒pfr/rxL.XTTUffljrJSW/图1:rpsL保真性分析的示意图确定PCR产物是单一片段后，用链亲和素的磁珠来纯化。简述如下：PCR产物与等体积预洗过的磁珠混合。室温反应15分钟并轻轻旋转混合。离心回收磁珠，重悬于1XHighBuffer50mMTris-HCl（pH=7.5）,100mM氯化钠，10mM氯化镁，1mMDTT，并用10个单位的MluI，37C消化过夜以

6、释放PCR产物。磁珠用一个磁性架回收，上清通过一个Micron-100微量纯化筒加以纯化。纯化的PCR产物在一个琼脂糖凝胶上分析，估计DNA浓度和模板加倍数目。DNA用T4DNA连接酶在16C连接2小时，然后转化MF101感受态细胞。细胞涂板于含氨苄青霉素的平板（100卩g/m）上来确定转化细胞的总数；涂板于含氨苄青霉素和链霉素（100卩g/m）平板以确定rpsL突变的总数。突变总数除以转化细胞总数来确定突变频率。突变频率除以130（造成rpsL表型变化的氨基酸数目）和模板加倍数来确定错误率。LacZ保真性分析：扩增条件，PCR产物纯化条件，连接和转化条件与rpsL分析中使用的一致。但是利用p

7、UC19作为模板；转化DH5a?细胞。转化细胞涂板在含氨苄青霉素（100卩g/m），X-gal（100卩g/m）和IPTG（1mM）的平板上。突变转化子选择可通过白色克隆的生长来确定。野生型克隆呈现蓝色克隆。如果克隆颜色不清楚可再涂布于氨苄青霉素/X-gal/IPTG平板，37C培养过夜。突变频率通过突变克隆总数除以转化细胞总数加以确定。错误率通过突变频率除以114（造成LacZ片段a互补表型改变的氨基酸数目）和模板加倍数目来确定。结果和讨论：DNA聚合酶的保真性用两种分析方法来确定。LacZ保真性分析法已经广泛应用于错误率的确定。它是基于测定LacZ基因突变导致其在含X-gal的平板上产生的

8、白色克隆。它需要大面积涂板，它会引入错误并导致不准确的计数。在rpsL分析中，rpsL基因编码小核糖体蛋白，S12,它对链霉素敏感。PCR诱导的突变使细胞获得对链霉素的抗性。含链霉素的平板上的正筛选可对突变体直接选择。另外，rpsL分析背景较低，因为rpsL的自发突变率低至10-6,而LacZ则为10（3）到10A（-4）。RpsL保真性分析结果显示PLATINUM?pfxDNA聚合酶的错误率比TaqDNA聚合酶低26倍（表1）。PLATINUM?DNA聚合酶是DNA聚合酶和抗DNA聚合酶抗体的混合物，适用于高特异性的自动热启动PCR和促进高通量筛选。加入TaqDNA聚合酶抗体产生PLATIN

9、UM?TaqDNA聚合酶对保真性没有影响。EnzymeMutationFrequency(%)TemplateDoubling(for25cycles)EorrorRate(X0A(-6)RelativeFidelityTaqDNAPloymerase4.000.091142191PlatinumTaqDNAPolymerase3.40.5103851.1PfuDNAPolymerase0.30.1103114PfuTurboDNAPolymerase0.270.07112.40.417PlatinumPfxPolymerase0.140.04121.60.526表1：用rpsL分析测定DNA

10、聚合酶的保真性。结果是5次独立的rpsL分析(2次25个循环和3次15个循环)结果的平均值SD。对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下，TaqDNA聚合酶(1,892/56,455)，PLATINUMTMTaqDNA聚合酶(2,043/57,695)，pfuDNA聚合酶(1,033/395,469),pfuTurboTMDNA聚合酶(1,068/395,468),PLATINUMTMpfxDNA聚合酶(960/584,230)。用LacZ保真性分析获得了相同的保真性数据(表2)。在所研究的几种DNA聚合酶中，PLATINUM?pfxDNA聚合酶有最低的错误率。EnzymeMutationFreq

11、uency(%)TemplateDoubling(for25cycles)EorrorRate(X0A(-6)RelativeFidelityTaqDNAPloymerase3.10.3141931PfuDNAPolymerase0.180.03111.10.415PlatinumPfxPolymerase0.090.01110.670.0629表2：用LacZ分析测定DNA聚合酶的保真性。结果是2次独立的LacZ分析（1次25个循环和1次15个循环）结果的平均值SD。对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下，TaqDNA聚合酶（2,975/93,688）,pfuDNA聚合酶（185/109,28

12、9），PLATINUMTMpfxDNA聚合酶（96/107,655）。所有突变克隆都重新涂布并在37C培养过夜以进行第二次真正突变体确定。酶的保真性会被缓冲液或其附加物所影响。PCRx增强溶液，它是针对高GC含量的模板的PCR反应的共溶剂，也在rpsL分析中进行了评价。PCRx增强剂能提高TaqDNA聚合酶的保真性2倍（图2）。PLATINUM?pfxDNA聚合酶的保真性不被PCRx增强剂所影响（数据未显示）。另外，在扩增反应中，当多种不同PCR缓冲液应用于pfuDNA聚合酶或PLATINUM?pfxDNA聚合酶时保真性没有明显变化（数据未显示）。AniountofPLfl,EnhncrMHu

13、boc图2.PCRx增强溶液对TaqDNA聚合酶的保真性的影响。用rpsL分析来确定在扩增反应中含有或不含PCRx增强液时TaqDNA聚合酶的错误率。数值是平均值SD（N=2）。附录C使用一步法RT-PCR从单一细胞中检测基因方法：分离单一细胞在去除了细胞培养基后，COS-7细胞用不含钙镁的DPBS（0.20g/LKCl,0.20g/LKH2PO4,8.00g/LNaCl,2.16g/LNa2HPO47H2O）清洗一次。力卩入Trypsin-EDTA（0.25%tryspsin,1mMEDTA4Na）到细胞中（3ml/75cm2培养瓶）并保温至最多5分钟。加入20ml生长培养基以终止胰蛋白酶的

14、活性。离心收集细胞。将细胞悬浮到DPBS中至大约1000个细胞/ml。取10卩悬浮液（大约10个细胞）点到清洁的盖玻片表面。用微量移液管在相差显微镜（NikonDiaphot倒置显微镜，200倍放大）下收集细胞。分离的细胞（在少于1卩的DPBS中）转移到0.2ml薄壁PCR管中图1.在显微镜下分离单个细胞一步法RT-PCR使用INVITROGEN的SUPERSCRIPT?One-StepRT-PCRwithPLATINUM?TaqSystem进行RT-PCR。图2.源自C0S-7细胞的一步法RT-PCR产物。1-3泳道分别是从1个，2个和5个细胞中扩增的人类肌动蛋白，使用的是有意义弓|物(CC

15、TCGCCTTTGCCGATCC)和反义弓I物(GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC)0C泳道则是没有加入反转录酶的扩增结果。第十二章疑难解答问题可能原因建议解决方法RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45C或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase.而且，在0.8mMDTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。RNA中包含逆转录抑制剂通过乙醇沉淀RNA除

16、去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25俱到0.4卩g/)以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。多糖同RNA共沉淀使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25C保温10分钟。对于基因特异性引物(GSP)，可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。起始RNA量不够增加RNA量。对于v50ng的RN

17、A样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1卩到0.5卩乙酰BSA。RNA模板二级结构太多将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火提高逆转录反应温度，对Superscripts可以到50C,对ThermoScript可以到65C。注意：不要在60C时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于1kb的RT-PCR产物，保持反应温度500单位)TaqDNAPolymerase，Recombinant10342-05310342-01210342-020100单位250单位500单位Platinum?TaqDNAPolymerase10966-01810966-026

18、10966-034100单位250单位500单位Platinum?PfxDNAPolymerase(包括Platinum?PfxDNAPolymerasePCRxEnhancerSolution，10PfxAmplificationBuffer和MgSO4)11708-01311708-02111708-039100单位250单位500单位Platinum?TaqDNAPolymeraseHighFidelity11304-01111304-029100单位500单位TaqPCRxDNAPolymerase(包括TaqDNAPolymerase,PCRxEnhancerSolution,10P

19、CRBuffer和MgCI2)11508-017500单位Platinum?TaqPCRxDNAPolymerase(包括TaqDNAPolymerasePCRxEnhancerSolution,10PlatinumPCRBuffer和MgCI2)11509-015500单位Platinum?GenoTypeTspDNAPolymerase11448-02411448-04011448-032250单位500单位2500单位Platinum?Taq抗体10965-01010965-028100单位250单位PCRSuperMix10572-014100反应Platinum?PCRSuperMi

20、x11306-016100反应PCRSuperMixHighFidelity10790-020100反应Platinum?QuantitativePCRSuperMix-UDG11730-01711730-025100反应500反应PCRReagentSystem10198-018100反应ELongaseAmplificationSystem10481-018100反应ELongaseEnzymeMix10480-01010480-028100反应500反应AccuprimeTaqDNAPolymeraseSystem12339-01612339-024200反应1000反应RT-PCR产品

21、货号规格SuperscriptsRNaseH-ReverseTranscriptase18064-01418064-02218064-0714X1000单位2000单位4X000单位SuperScriptsRNaseH-ReverseTranscriptase18053-0171000单0位SuperScriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR包括oligo(dT)12-18,randomhexamers，SuperScriptsRT，RNaseOUTRNaseInhibitor，10XRTbuffer，Mgsolution,10mMdNTPmix,E.

22、coliRNaseH,controlRNA和primers以及DEPCtreatedwater)。11904-01850反应SuperScriptOne-StepRT-PCRSystemwithPlatinumTaqDNAPolymerase(包括SuperScriptsRT/PlatinumTaqDNAPolymerasemix,2Xreactionbuffer,MgSO4)10928-03410928-04225反应100反应SuperScriptOne-StepRT-PCRSystemforLongTemplates(包括SuperscriptsRT/PlatinumTaqDNAPoly

23、meraseHighFidelitymix,2Xreactionbuffer,MgSO4)11922-01011922-02825反应100反应ThermoScriptRT-PCRSystem(包括ThermoScriptRT,5XsDNASynthesisBuffer,Mgsolution），oligo（dT）20，randomhexamers，0.1MDTT，10mMdNTPmix，RNaseOUTRNaseInhibitor,DEPCtreatedwater以及E.coliRNaseH）。11146-02411146-01625反应100反应ThermoScriptRT-PCRSyste

24、mandPlatinumTaqDNAPolymerase11146-05711146-03225反应100反应ThermoScriptRT-PCRSystemandPlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity11146-040100反应Platinum?QuantitativeRT-PCRThermoScriptOne-StepSystem11731-01511731-023100反应500反应M-MLVReverseTranscriptase28025-01328025-02140000单位200000单位RT-PCRPrimerandControlSet包括He

25、laRNA和gactinprimers）。10929-01620反应RibonucleaseH18021-01418021-07130单位120单位DNaseI,AmplificationGrade18068-015100单位RNaseOUTRecombinantRibonucleaseInhibitor10777-0195000单位DEPC-treatedWater10813-01241.25ml5RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnd,Version2.018374-05810反应3RACESystemforRapidAmplificationof

26、cDNAEnd18373-01920反应GeneRacer?KitwithSuperScript?nRTandTOPOTACloning?KitforSequencingL1502-011kit*GeneRacer?KitwithSuperScript?nRTandZeroBlunt?TOPO?PCRCloningKitforSequencingL1502-021kit*Plantinum?TaqDNAPolymeraseHighFidelity11304-011100单位*Includessufficientreagentsfor5cDNA,50PCR,and10cloningreactio

27、ns,and1controlreaction.反应成分产品货号规格InvitrogenCustomPrimers请询价10mMdNTPNucleotideMix18427-013100卩l100mMdNTPNucleotideSet102970184x250卩l核酸纯化产品货号规格TRIzol?Reagent15596-02615596-018100ml200mlTRIzolLSReagent10296-01010296-028100ml200mlDNAzol?Reagent10503-02710503-035100ml200mlDNAzolBDReagent10974-020100mlCon

28、cert?PlantRNAReagent12322-012100mlConcert?CytoplasmicRNAReagent12323-010100mlConcert?Micro-to-MidiRNAPurificatiorReagent12183-01850rxnsConcert?Homogenizer12183-02650rxnsBuffered-SaturatedPhenol15513-03915513-047100ml400mlProteinaseK25530-01525530-031100mg5gProteinaseK(Liquid)25530-0495mlMarligenRapi

29、dPCRPurificationSystem11458-01511458-02350反应250反应MarligenRapidGelExtractionSystem11456-01911456-02750反应250反应定量PCR和定量RT-PCR产品货号规格PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG11730-01711730-025100rxns500rxnsRUXReferenceDye12223-012500rxnsPlatinum?QuantitativeRT-PCRThermoScript?11731-01511731-023100rxns500rxnsRO

30、XReferenceDye*12223-012500rxns其他应用产品产品货号规格AFLP?AnalysisSystemI（基因组介于5X108到6X109之间）（包含AFLPCoreReagentKit和AFLPStarterPrimerKit）10544-013eachAFLP?AnalysisSystemn（基因组介于1X0A8到5X08之间）（包含AFLPCoreReagentKit和AFLPSmallGenomePrimerKit）10717-015eachAFLP?SystemforMicrooranisms（为细菌和真菌设计）11352-010eachPCR相关产品产品货号规格

31、100bpDNALadder15628-01915628-05050ug250ug1kbPlusDNALadder10787-01810787-026250ug1000ug0.6-1.77KbRNALadder15623-01075ug0.24-9.5KbRNALadder15620-01675ugSiliconeOil10890-0104mlUracilDNAGlycosylase18054-015100单位PCR产物克隆产品货号TOPOTACloning?KitK4500-01K4550-01K4560-01TOPOTACloning?KitDualPromoterK4600-01K465

32、0-01K4660-01TOPOTACloning?KitforSequencingK4575-01OriginalTACloning?KitK2000-01K2030-01OriginalTACloning?KitDualPromoterK2050-01K2060-01VariousAlltheTOPOExp.KitsZeroBlunt?TOPO?PCRCloningKitK2800-20ZeroBlunt?TOPO?PCRCloningKitforSequencingK2875-20ZeroBlunt?PCRCloningKitK2700-20TOPO?XLPCRCloningKitK47

33、00-10ProkaryoticPCR?T7/NTTOPOTACloning?KitPCR?T7/CTTOPOTACloning?KitK4200-01K4210-01pBADTOPOTACloning?KitpBAD/TOPO?ThioFusion?ExpressionSystemK4300-01K370-01pTrcHisTOPOTACloning?KitpTrcHis2TOPOTACloning?KitK4410-01K4400-01YeastpYES2.1TOPOTACloning?KitK4150-01InsectpBlueBac4.5/V5-HisTOPOTACloning?Kit

34、K2100-20pIB/V5-HisTOPOTACloning?KitK890-20MammalianpcDNA4/HisMaxTOPOTACloning?KitK864-20pcDNA3.1/V5-HisTOPOTACloning?KitK4800-01pEF6/V5-HisTOPOTACloning?KitK9610-20pIND/V5-HisTOPOTACloning?KitK1010-01NT-GFPFusionTOPO?CloningKitCT-GFPFusionTOPO?CloningKitK4810-01K4820-01pBlueTOPOTACloning?KitpGlowTOP

35、OTACloning?KitK4831-01K4830-01pVP22/myc-HisTOPOTACloning?KitpVP22/myc-His2TOPOTACloning?KitK4840-01K4850-01附录A引物序列精选RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）3-actin人有意义链反义链CCTCGCCTTTGCCGATCCGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC0.62-actin*大鼠有意义链反义链TACAACCTCCTTGCAGCTCCGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC0.623-actin小鼠有意义链反义链GTCGTACCACAGGCATTGT

36、GATGGGCAATGCCTGGGTACATGGTGG0.49GAPDH人有意义链反义链GGTGAAGGTCGGAGTCAACGCAAAGTTGTCATGGATGHACC0.50GAPDH大鼠有意义链反义链GATGCTGGTGCTGAGTATGRCGGTGGTGCAGGATGCATTGCTCTGA0.20Dynein小鼠有意义链反义链GCGGGCGCTGGAGGAGAAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC12.3PolymeraseA有意义链反义链CGCCAAATTTCTCCCCTGAAACCGTAGTGCTGGGCAATGTTC6.8Polymerase人有意义链反义链AAGGCT

37、GGCGGATTACTGCCGATGCTGCTGGTGATGTACTC3.5TuberousSclerosis人有意义链反义链GGAGTTTATCATCACCGCGGAAATACTGAGAGTATTTCACTGACAGGCAATACCGTCCAAGG5.318SrRNA大豆有意义链反义链CTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC1.5*引物不会扩增假基因PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）HIVgagregion病毒SK38SK39ATTAATCACTATCCAGTAGGAGAAATTTTGGTCCTGTCTTATGTCCAGAATGC0.11globin人2992334016GGTGTTCCCTTGATGTAGCACACCAGGATTTTTGATGGGACACG4.13-gl