表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839对宫颈癌细胞的作用

1、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839对宫颈癌细胞的作用【摘要】目的讨论选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839对宫颈癌细胞的作用。方法以宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌Hela细胞为研究对象，利用TT法检测ZD1839单药使用以及与顺铂联用分别对Siha和Hela细胞的增殖抑制作用。采用Burgi法分析结合用药的效果，并用流式细胞仪检测Siha和Hela细胞的细胞周期分布及凋亡率改变。结果单独使用ZD1839可以抑制Siha、Hela细胞的增殖，其I50值分别是1.48l/L、2.67l/L，而且抑制作用呈剂量依赖性。ZD1839能增强顺铂对Siha、Hela细胞的抑制作用，Bur

2、gi修正公式所得Q值分别为1.060.03Siha、1.130.01Hela。ZD1839使G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加。结论ZD1839可以抑制宫颈癌细胞的增殖，并且可以增强顺铂对宫颈癌细胞的抑制作用，该抑制作用可能与其使肿瘤细胞停滞于G1期和诱导肿瘤细胞的凋亡有关。【关键词】宫颈癌；ZD1839；细胞增殖；细胞周期；凋亡宫颈癌发病率占女性生殖器官恶性肿瘤的首位。目前，放射治疗是其主要治疗方法，但疗效并不令人满意。为进一步进步其疗效，人们研究包括顺铂等化疗药物在内的综合治疗手段，虽然获得了一定的疗效，但严重的毒副作用限制了其应用。ZD1839是一种新开发的可供口服的选择

3、性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，已被美国FDA批准用于晚期非小细胞肺癌的治疗。由于宫颈癌细胞存在表皮生长因子受体的高表达，阳性表达率达90%以上1。我们推测针对表皮生长因子受体靶点的特异性抑制剂ZD1839，可能对其会有一定的治疗效果，因此，我们以宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌Hela细胞为研究对象，通过体外研究试图讨论ZD1839对宫颈癌细胞的作用及其可能机制。1材料与方法1.1药物及试剂1.2细胞及培养1.3TT实验取对数生长期细胞制成1.5104/l细胞悬液，接种96孔板，每孔200l即3103个细胞/孔。置于培养箱中培养。待细胞贴壁2h后，吸弃旧培养液，参加各受试物继续培养24h后，每

4、孔加TT液20l(5g/l)，继续孵育4h，吸弃每孔培养液，参加150lDS，用酶联仪以波长570n测定各孔A值。实验设药物处理组、细胞对照组和空白对照组，每组均设3个复孔。药物处理组在铺孔10h后参加含不同浓度药物的20l培养液；细胞对照组参加200l培养液;空白对照组在铺孔时不加细胞悬液，只加200l培养液。在单药对Siha、Hela增殖抑制作用的实验中，药物处理组参加ZD1839的终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50和100l/L。在ZD1839与顺铂联用对Hela、Siha细胞抑制作用的实验中，分别检测了0.1、0.5、1.0、5.0l/L和10l

5、/L的ZD1839与0.5、1、2、5和10g/l的顺铂联用对Hela、Siha细胞的抑制作用。实验重复3次，取3次实验结果的平均值作为实验结果。按以下公式计算肿瘤细胞增殖抑制率：肿瘤细胞增殖抑制率%1药物处理组A值-空白对照组A值细胞对照组A值-空白对照组A值100%1.4Brgi法分析结合用药效果根据细胞增殖实验测得ZD1839和顺铂的I50值，各取ZD1839和顺铂的I50值的半量单药或两药结合作用于Siha、Hela细胞，利用TT法测得抑制率，并按以下公式计算Q值，判断两种药物结合作用的效应。Q平均EA/2+B/2平均EA/2+平均EB/2平均EA/2为1/2I50值的ZD1839组抑

6、制率，平均EB/2为1/2I50值的顺铂组抑制率，平均E(A/2十B/2)为各取ZD1839和顺铂I50值的半量两药结合作用的抑制率。Q1为增强，Q=1为相加，Q1为拮抗。上述实验重复3次，取平均Q值为实验结果。1.5流式细胞术分析细胞周期分布及细胞凋亡情况取药物处理组及对照组细胞各约1106个，用PBS缓冲液洗2次后，以-20预冷的80%乙醇溶液于4冰箱中固定过夜。将固定好的细胞1000r/in离心5in，弃去上清液，PBS缓冲液漂洗两次，将细胞悬液移至样品试管中，每管各加1%RNA酶100l，37水浴30in，参加碘化丙啶100l，使终浓度为50g/l，染色5in，4避光30in后，在FA

7、srt型流式细胞仪美国BD公司产上用488n激发光激发检测细胞的周期分布及凋亡情况。药物处理组分别参加0.1l/L、0.5l/L、1.0l/L、5.0l/L、10l/L的ZD1839。实验重复3次取3次实验结果的平均值作为实验结果。1.6数据处理计量数据以均数标准差表示，显著性检验采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1ZD1839单药对Siha、Hela细胞增殖的抑制作用ZD1839对Siha、Hela细胞的增殖均有明显的抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖性，其抑制Siha、Hela细胞增殖的I50值分别是1.48l/L、2.67l/L。2.2ZD1839与顺铂联用对Siha、H

8、ela细胞的作用ZD1839能增加顺铂对Siha、Hela细胞的增殖抑制作用,单用顺铂Siha：0.54g/L、Hela：0.73g/L组抑制率%分别为29.30.2、27.20.3；顺铂Siha：0.54g/L、Hela：0.73g/LZD1839Siha：0.74l/L、Hela：1.34l/L组抑制率分别为53.10.3、51.30.7。进一步用Brgi法分析两药的联用效果，按公式计算出Q值为1.060.03Siha，1.130.01Hela，说明ZD1839结合顺铂能增强抑制Siha、Hela细胞生长的作用，两者结合作用具有协同效应。2.3ZD1839对Siha和Hela细胞周期分布的

9、影响用流式细胞仪检测不同浓度的ZD1839作用后的Siha、Hela细胞的细胞周期分布情况。结果ZD1839可以使Siha、Hela细胞停滞于G1期，见表1、图1。2.4ZD1839对Siha和Hela细胞凋亡的影响3讨论ZD1839是一种选择性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，可以通过阻断信号传导途径而抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管生成，相关研究已经证实ZD1839对多种肿瘤均有抗肿瘤活性，而且不管是连续给药还是持续给药，都具有很好的耐受性7。在体外试验中，ZD1839对一系列肿瘤细胞株，如口腔癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌细胞等显示出明显的抑制作用8，体内试验也证实其能抑制前

10、列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等肿瘤的生长9，10，随后进展的临床研究说明其对非小细胞肺癌有着较好的治疗效果7，11，12，美国食品与药物管理局FDA也已批准ZD1839用于治疗晚期非小细胞肺癌。宫颈癌的表皮生长因子阳性表达率很高，可达90%以上13,因此推测针对表皮生长因子受体靶点的特异性抑制剂可能会有一定的治疗效果。我们用TT法检测ZD1839对宫颈癌Siha、Hela细胞的生长抑制作用。研究结果显示单独使用ZD1839对宫颈鳞癌细胞株Siha和腺癌Hela细胞株的增殖有明显的抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖性。我们研究发现，ZD1839抑制Siha、Hela细胞

11、增殖的I50值分别是1.48l/L、2.67l/L，与Ransn8报道的ZD1839抑制其他类型肿瘤细胞系的I50值范围一致。Hpfner等16报道ZD1839可诱导肝癌细胞株细胞周期停滞并可促进细胞凋亡。在我们的实验研究中，流式细胞仪分析显示，ZD1839也可诱导宫颈癌Siha、Hela细胞停滞于G1期，当ZD1839浓度为10l/L时G1期的比值分别从对照组的45.08%、45.58%上升到67.22%、72.87%P0.05。随着ZD1839浓度的增加Siha、Hela细胞凋亡比率有逐渐增加的趋势，这说明ZD1839对Siha、Hela细胞抗肿瘤细胞增殖可能主要是通过促凋亡和诱导细胞周期阻滞而起作用。总之，由于EGFR在多种类型的实体瘤中呈现高表达，且与对治疗的低反响率、低生存率和疾病进展亲密相关，实验研究显示通过多种途径作用于EGFR的信号转导通路，可以抑制肿瘤细胞增殖、减少肿瘤血管生成和肿瘤细胞转移，以及增加肿瘤