临床免疫学检验：免疫原和抗血清的制备

1、免疫原和抗血清的制备 第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制第三节 抗血清的制备 一、免疫动物 二、免疫方法 三、动物采血法 第四节 抗血清的纯化 一、特异性抗体的纯化 二、IgG类抗体的纯化 第五节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存 第一节 免疫原的制备免疫原(immunogen)是能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞，并能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 颗粒性抗原细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸 免疫原是制备

2、高质量诊断抗体的关键一、颗粒性抗原的制备天然的颗粒性免疫原包括：细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵 绵羊红细胞的制备流程图 摇动15-20min 可保存3周 取适量 NS洗涤3次2000r/min 10minNS配置成106/mL细胞悬液 绵羊红细胞 细菌抗原的制备流程图液体培养或 斜面培养 3724h100水浴 22.5h 无菌试验NS稀释成810亿/ml 菌体抗原二、可溶性抗原的制备和纯化蛋白质、细菌毒素、糖蛋白、脂蛋白、酶类和核酸等均为可溶性抗原。来源：组织和细胞，成分复杂需纯化制备过程：选取合适的组织和细胞将其粉碎；选用适当的方法提取目的蛋白；选用适

3、当的方法纯化抗原；鉴定抗原的纯度。 上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5gL NaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000rmin10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心组织匀浆的制备细胞抗原一般分为膜蛋白抗原、细胞质抗原、细胞核抗原及核膜抗原，这些抗原的制备需将细胞破碎。1.冻融法2.超声破碎法3.酶处理法4.表面活性剂处理细胞破碎技术 反复冻融法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：将待破碎的细胞置-20冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细

4、胞内的颗粒可被融破。 特点：此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。 超声破碎法原理：利用超声波（120kHz）的机械振动使流体局部减压而发生内部液体流动、旋涡生产和消失，产生强大压力使细胞破碎。 特点：操作简单，重复性较好，节省时间； 多用组织细胞的破碎。 超声破碎时必须间歇进行，可采用冰浴以避免因长时间产热对抗原的破坏。常用酶类：溶菌酶 方法：在碱性条件下，溶菌酶能溶解革兰阳性菌的细胞壁 特点：此法适用多种微生物细胞； 作用条件温和；内含物成分不易受到破坏； 细胞壁损坏的程度可以控制。 酶处理法 表面活性剂处理原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡

5、， 使膜的渗透性改变而导致细胞溶解。常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、吐温、Triton-100等。应用：破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。1、超速离心法： 差速离心法低速和高速离心交替进行，用于分离大小差别较大的抗原； 密度梯度离心法区带离心法，利用各颗粒在一定密度梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。 可溶性抗原的纯化应用：用于少部分大分子抗原（如IgM、C1q、甲状腺球蛋白）和一些比较轻的抗原物质（载脂蛋白A、B）的分离。2、选择性沉淀法： 核酸去除法氯化锰、硫酸鱼精蛋

6、白、链霉素 盐析法硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮 聚合物沉淀法聚乙二醇 盐析: 蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面离子及其周围水分子的数目。在蛋白质溶液中加入中性盐后，可中和蛋白质表面的电荷，同时使蛋白质周围的水化层减弱乃至消失，造成蛋白质分子之间聚集而沉淀，称为“盐析”。最常用的盐溶液是33%-50%饱和度的硫酸铵。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂： 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 凝胶过滤法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离 流动相

7、为缓冲液，固定相为胶体孔隙內的缓冲液。 溶质 (样本蛋白质) 根据其分子量 的大小，决定分布在这两相的比例。 分子量大的不易进入胶球，随流动相流出；分子量小的，则易进入胶球內的固定相，而被延滞流出胶柱 。分子的 形状、大小 均为影响因素，即与其 分子半径(Stokes radius) 有关，与分子量不完全成正比关系；但一般均视蛋白质为球形，故其形状影响不大。凝胶过滤法将带电离子基团引入纤维素或凝胶，使之成为离子交换剂，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。流动相为缓冲液，固定相为介质表面的带电基团。 样本中各种离子，与介质表面带电基团间的亲和力强弱不同，吸附上去之后，可使用不同离子浓度的缓冲液，分別

8、解离出这些成分 亲和层析法：通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。最常用的支持物是Separose4B 亲和层析法较其它纯化方法更有效，而且分离迅速。（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA免疫球蛋白片段的制备：非共价键解离法改变pH 、利用强变性剂 共价键解离法氧化法和还原法 断裂肽链-溴化氰裂解法、 酶解法（木瓜酶 、胃蛋白酶） 酶水解免疫球蛋白示意

9、图Fc段，用以制备抗重链血清F(ab)2，常作为抗体试剂用于试验胰蛋白酶(pepsin)胃蛋白酶(pepsin)木瓜蛋白酶（papain)人工抗原的制备 用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构表位的抗原，称为人工抗原。（一）人工结合抗原（半抗原+载体）（二）人工合成抗原(用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽）（三）基因重组抗原半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等 载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、血蓝蛋白（KLH）多肽聚合物：多聚赖氨酸（polyly

10、sine） 大分子聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 半抗原与载体的连接方法物理方法：利用电荷和微孔吸附半抗原 化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 第二节 佐剂佐剂（adjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。一、佐剂的种类具有免疫原性的佐剂:细胞因子、细菌及代谢产物（如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 LPS ）无免疫原性的佐剂：液状石蜡、羊毛脂、氢氧化铝、明矾、矿物油以及人工合成的多聚肌苷酸 胞苷酸(poly IC)、脂质体 常用于动物实验的佐剂： 福氏佐剂(Freunds

11、adjuvant) 福氏不完全佐剂：羊毛脂+液体石蜡 福氏完全佐剂：弗氏不完全佐剂+卡介苗乳化方法： 研磨法和搅拌混合法 乳化效果二、佐剂的作用机制改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。 第三节 抗血清的制备 抗血清的制备是将免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体多克隆抗体的产生示意图多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆

12、产生的多种抗体的混合物 一、免疫动物的选择抗原来源与动物种属的关系 种属差异越远，免疫原性越强 动物个体的选择 适龄、健康、体重符合要求 抗原的性质二、免疫程序免疫原的剂量 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 免疫间隔时间 第一次和第二次间隔1020天，三次及以后间隔710天免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结 三、动物采血法颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊 第四节 抗血清的纯化抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分,防止抗

13、血清中其他杂抗体干扰试验结果。一、 IgG类抗体的纯化盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层析柱 第五节 抗血清的鉴定和保存一、抗血清的鉴定抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验 二、抗血清的保存28保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存510年二、特异性抗体的

14、纯化有时由于免疫原的不纯，含有性质相近的杂抗原，可导致免疫血清中存在杂抗体，为得到单价特异性抗血清，可用亲和层析法和吸附法去除杂抗体。亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗原混合液制成固相吸附剂1什么是免疫原？ 2如何制备可溶性抗原？ 3常用的细胞破碎方法有哪些？ 4连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些？5纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？ 6什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的作用机制有哪些？7什么是抗血清？什么是多克隆抗体？ 8如何制备抗血清？ 9动物采血有哪些方法？ 10抗血清的鉴定包括哪些内容？思考题小 结 免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质