复旦大学基因诊断与基金治疗教案04-1基因诊断技术与方法（上）

1、第四章 基因诊断技术与方法（上）基因诊断技术与方法 基因诊断技术主要分为 分子杂交技术、聚合酶链反应、DNA测序技术、荧光原位杂交、生物芯片、免疫组织化学技术和其他基因诊断技术。以下我们分别详细介绍。1 分子杂交技术1.1 分子杂交技术的定义两个分子之间由于化学上的作用，通过化学键结合在一起称为分子杂交。在生物学上，人们利用这一原理，在将已知分子制备成带一定可被检测的标记（如同位素）的条件下，来检测另一分子的存在与否及含量多少等等，称为分子杂交技术。 被标记的分子称为探针(probe)，被检测的分子称为标点(target)。利用一条（寡）核苷酸链探针，可实现对另一种核苷酸链的检测，包括DNA-

2、RNA、DNA-DNA、RNA-RNA、抗原与抗体间的分子杂交，蛋白质与DNA之间的分子杂交等等。这些都是基因及其产物分析中的常用方法1.2 分子杂交技术的历史 Hall等于1961年创立：分离某些标的核酸分子 1962年Bolton等创立了固相核酸杂交 (solid phase hybridization) 1968年Britten等开始了DNA-DNA杂交的动力学研究 1972年Aviv利用多聚U-Sepharose和寡聚dT -纤维素（cellulose）从总RNA中分离含有多聚A的mRNA 1976年Weiss等还从网织细胞(reticulocyte)RNA中纯化主要为-珠蛋白mRNA

3、和-珠蛋白mRNA的mRNA混合液，并经寡聚dT引物，以-珠蛋白mRNA、-珠蛋白mRNA为模板，在RNA依赖的DNA聚合酶（反转录酶）的作用下合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)探针来分析珠蛋白基因的表达。由此开始了利用这一技术进行某些特定基因表达研究的探索。 70年代在细菌中发现限制酶(restriction enzyme)或称为限制核内切核酸酶(restriction endonuclease)。1.3 分子杂交技术的技术路线 分子杂交技术路线分为 1.样品的分离、纯化。 2.限制酶及限制酶切反应。 3.探针的制备。 4.分子杂交。 以下我们分别详述各步骤。1.

4、3.1 样品的分离、纯化1.3.1.1 核酸的分离、纯化核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密切联系。它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理也有密切的关系。因此，核酸是现代生物化学、生物学与医学的重点研究课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。提取纯化核酸关键在于保持核酸的完整性。但要做到这一点比较困难，一是因为细胞内存在活性很高的核糖核酸酶；二是化学因素，过氧过碱以及其它化学因素；三是物理因素，如高温、机械牵拉等可使核酸降解。真核细胞基因组DNA的分离与纯化DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA

5、等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中。高等动植物细胞中的染色体含有大量的DNA，对其结构和功能的研究又是分子生物学的中心课题。为了在DNA的研究中获得可靠结果，制备高纯度大分子量的DNA样品十分重要的。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤是破碎细胞、去处与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类以及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子。细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用蛋白酶K和去垢剂SDS等温和的方法破碎细胞。纯化则根据其本身的特征用不同方法。细胞基因组DNA的提取是多种分子生物学和

6、细胞生物学研究的重要步骤。它对于电镜下研究DNA结果及用DNA介导的基因转移进行人类基因定位、原位杂交等方面都很有意义。具体操作方法如下：动物处死，迅速取出组织块，剪碎后，置入液氮中；用冰冷的组织捣碎器捣碎2001000mg组织，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；将悬浮细胞收集，500g5min离心，或贴壁细胞用胰酶消化收集离心；将培养细胞中加入110ml的冰冷的PBS，500g5min离心，弃上清，重复一次、用一倍体积的消化液悬浮细胞；如细

7、胞数3107，则加入消化液0.3ml；如细胞数较多，则每108个细胞加入1ml消化液；细胞移入带盖的离心管中，50消化1218h；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，1700g10min离心，将上层液体移入一个新的离心管中，如果离心后分层不明显，可再重复消化和离心；如果离心后，交界面上有一白色薄膜，再重复酚/氯仿/异戊醇抽提；在上清液中加入1/2体积的7.5mol/L醋酸氨，2倍体积的100%乙醇溶液，混匀，12000g离心。为防止大分子基因组DNA的剪切，加入100倍体积的TE缓冲反应24h以上，以除去有机溶剂和盐，不需进行步骤；用70%乙醇溶液洗涤，晾干；溶于适量的TE中，DNA终浓度为1

8、ml/ml；加0.1%SDSD和1g/ml RNA酶，37孵育1h，重复步骤、。一般1g细胞可得2mg基因组DNA。真核细胞RNA的分离提取RNA是基因表达产物。RNA存在于细胞质中，核糖体最多，细胞核内也有，主要在核仁部位，线粒体等也有少量。细胞中的RNA有以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%85%）、tRNA和核内小分子RNA（占1015%）、mRNA（占15%）。其中mRNA是分子生物学主要的研究对象。RNA提取工作要求很严，对研究基因的转录调控、基因的克隆和表达、cDNA文库的构建具有重要作用。分离制备RNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。从细胞中

9、分离的RNA的质量至关重要 ，其中关键是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变形剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。主要步骤为将细胞或组织进行匀浆，目前用已知的最强的RNA酶抑制剂异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、巯基乙醇联合抑制RN

10、A酶，并使核蛋白复合物解离，使RNA易于进入无DNA的水相，容易被异丙醇浓缩。纯化RNA的方法比较多，有热酚法、氯化铯超离心法等。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。具体操作方法包括：特殊处理：所有玻璃器皿160180高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理；取组织50100mg，加0.8ml Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min；加0.2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min，4，12000g15min离心。弃沉淀；取上清，加入0.5ml异丙醇，颠

11、倒混匀。20静置2h，4，12000g10min离心；弃上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4，7500g5min离心；弃上清，沉淀真空干燥10min；加40l DEPC溶液，充分溶解RNA；取2l RNA溶解液，250倍稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，如果比值大于1.7，说明RNA纯度尚可。根据下述公式计算RNA浓度：RNA浓度（g/l）OD260稀释倍数40/1000。1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量，电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜；制1%甲醛变性凝胶板：4.5l RNA，2ul 5甲醛胶电泳缓冲液，3.5l 3

12、7%甲醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2l RNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳12h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品70保存备用。随着科技的发展，也有许多新型纯化方法，使用试剂盒即可简单的完成分离纯化步骤，如使用纤维素柱纯化mRNA：使用 Poligo(dT)-纤维素层析法提取poly(A)+RNA1.3.1.2 蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离纯化方法很多：根据蛋白质溶解度不同，有1、盐析法中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓

13、度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子可夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。2、等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。3、低温有机溶剂沉淀法 用与水

14、可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。根据蛋白质分子大小的差别，有1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。2、凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。根据蛋白质带电性质不同，有1、电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分

15、子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。2、离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。根据配体特异性结合，有：亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经

16、过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。1.3.2 限制酶及限制酶切反应1.3.2.1 限制酶的概念 许多细菌中都具有能识

17、别DNA特异位点的限制酶，其目的是使带有该特异位点的外来DNA降解，以保持细菌自身遗传物质的稳定，是细菌的一种自我保护机制。然而现代分子生物学技术则利用限制酶的特异识别与特异切割特性，建立了重组DNA技术，使人类基因的克隆、分离、基因的分析、诊断成为可能。1.3.2.2 限制酶的类型 类和类限制酶 具有特异切割活性，又具有修饰作用 前者需要ATP 它们所切割的部位往往远离识别部位 类限制酶 它们往往没有修饰作用 切割时也不需要ATP提供能量 切割的部位往往与识别部位相同或邻近1.3.2.2.1 类限制酶识别位点的特点 常为46减基，且为迥文对称(palindromes)(DNA的碱基组成在双链

18、中，从53是相同的)，包括四种类型： 迥文对称； 间隔迥文对称(interrupted palindromes)，如Hinf、Xmn； 兼并迥文对称，如EcoR、Hinc，即迥文序列中有个别碱基可有变化； 非迥文对称，如Mbo。1.3.2.2.2 类限制酶的命名原则 一般而言，限制酶的名称由34个字母组成，罗马数字表示该酶在同类酶中的发现次序1.3.2.2.3 类限制酶的部分常用酶部分常用限制酶： 酶识别位点切割位点53缓冲液Aat IIGACGTCKAlu IAGCTLAva ICYCGRGLAva IIGG(A/T)CCLBgl I (Msc I)1TGGCCAO(L)Bam HIGGAT

19、CCMBgl IIAGATCTMBcl ITGATCALBsp106I (ClaI)1ATCGATM(O)Eco RIGAATTCMEcoRII (BstNI)1CC(A/T)GGM(L)Hae IIIGGCCLHinc IIGTYRACL(M)Hind IIIAAGCTTLHinf IGANTCLHpa IGTTAACLKpn IGGTACCOMbo IIGAAGANNNNNNNOCTTCTNNNNNNNMbo I (Sau3A)1GATCL(L)Msp I (Hpa II)1CCGGO(O)Not IGCGGCCGCMPst ICTGCAGLPvu ICGATCGMPvu IICAGCTG

20、MRsa ICTACOSac I (Sst I)1GAGCTCO(L)Sac II (Sst II)1CCGCGGO(L)Sal IGTCGACHSfi IGGCCNNNNNGGCCLSma ICCCGGGKSph IGCATCCMStu IAGGCCTLTaq ITCGALXba ITCTAGALXho ICTCGAGLXma I(PspA I)1CCCGGGOXmn IGAANNNNTTCO注：R为嘧呤，Y为嘧啶，N为任何碱基缓冲液组成为：K： 10mM Tris-Cl pH8O： 10mM Tris-Cl pH7.4 10mM MgCl2 10mM MgCl2 20mM KCl 1mM

21、DTTL： 50mM NaClM： 100mM NaCl 10mM Tris-Cl pH7.4 10mM Tris-Cl pH7.4 10mM MgCl2 10mM MgCl2 1mM DTT 1mM DTT H： 150mM NaCl 10mM Tris-Cl pH7.4 10mM MgCl2 1 nM DTT1.3.2.3 限制酶切反应 DNA分子在限制酶的作用下，识别特定的切割位点，把DNA切割成特定大小和数量的片段。酶切反应需要在一定的条件下进行（如温度、时间、离子浓度等）1.3.2.3.1 限制酶切反应限制酶切割DNA双链产生新的5磷酸基端和3羟基端，断裂的两条多核苷酸链可以是平整的

22、，称为钝性末端(blunt ends)，如Sma I；也可以是错开的，称为粘性末端(cohesive ends)，此时为3稍长(3 overhang)(如Kpn I)或为5稍长(5 overhang)(如BamH I)。如果识别位点是迥文对称结构或不完全迥文对称结构，切割位点常在识别位点之内产生相同粘性末端的限制酶 1.5AATT 组EcoR I(GAATTC), Mun I(CAATTG) 2.5GATC 组BamH I (GGATCC), Bcl I (TGATCA), Bgl II (AGATCT), Mbo I (GATC), Xho II (RGATCY) 3.5CTAG 组Avr

23、II (CCTAGG), Nhe I (GCTAGC), Spe I (ACTAGT), Xba I (TCTAGA) 4.5CCGG 组BspM II (TCCGGA), Xma I (CCCGGG) 5.5TCGA 组Sal I (GTCGAC), Xho I (CTCGAG) 6.3CATG 组Nla III (CATG), Sph I(GCATGC) 7.3TGCA 组Nsi I(ATGCAT), Pst I(CTGCAG)1.3.3 探针的制备1.3.3.1 什么是探针从化学或生物学上来说，探针是与被测的特定标的有强的交互反应的分子：抗原-抗体、受体-配体、DNA-DNA、DNA-R

24、NA、DNA-蛋白质等等，不同的探针标的之间的交互反应的原理不同，对于基因诊断技术中常用的DNA-DNA或DNA-RNA反应来说，主要是互补碱基(如G与C、A与T)之间形成氢键。因此，利用带有一定标记的探针来检测样品中标的存在与否是基因分析的重要方法之一。1.3.3.2 探针的类型探针有生物来源的、也有化学来源的，前者常为克隆的基因组DNA或从mRNA反转录来的cDNA，或者是通过PCR扩增后制备的（克隆的或未克隆的）DNA片段，后者则为人工合成的具有特定序列的寡核苷酸片段(oligomer或olignucleotide)1.3.3.3 寡核苷酸片段作为探针的特点 省时，由于寡核苷酸短，分子量

25、小，它与标点杂交所需要的时间就比克隆的探针要少得多，相应地，其效率就高得多； 特异性高，由于寡核苷酸探针较短，因此它与标点杂交时配对要求较高，如果有一个碱基的不配(mismatch)就会使杂交效率改变，利用这一点可对单碱基突变进行分析，而克隆的探针则不能做到这一点； 可根据实际要求，设计不同长度、不同碱基组成的寡核苷酸探针，而克隆的探针则是固定不变的。1.3.3.4 寡核苷酸片段作为探针的条件 (1) 寡核苷酸探针的长度在1850核苷酸(nucleotide, nt)之间，过长则将增加杂交时间，而探针太短则降低杂交的特异性；(2) 寡核苷酸探针的碱基组成中G+C的比例在4060，如果超过这一比

26、例将会增加杂交的非特异性；(3) 要确认不会因寡核苷酸内配对而形成发夹样结构，因为这将影响探针与标的的结合；(4) 寡核苷酸内的序列要避免同一碱基连续出现4次以上，即-GGGG-可能是允许的，而-GGGGG-则是十分不可取的；(5) 依据上述标准，在完成序列设计后，可能的话应进行计算机序列分析，如果所设计的序列与非标的区有70%的相似性或连续有8个以上的核苷酸相同则应重新设计寡核苷酸探针，以防出现假阳性。1.3.3.5 抗原-抗体反应中的探针对于抗原-抗体反应来说，抗体在多数情况下可作为探针。某些抗原具有天然抗体，可通过免疫学方法予以制备，某些抗原则不具有天然抗体或尚不知道其天然抗体，则可通过

27、免疫动物的方法制备单克隆或多克隆抗体用于抗原的分析1.3.3.6 核酸探针的标记核酸探针如今已被广泛应用于分子生物学的许多研究领域中。最早使用的放射性同位素标记的核酸探针以其灵敏度高和特异性强等特点，一直沿用至今。但因放射性同位素半衰期短、具放射性污染、成本高等原因，促使人们去不断地寻找其它的探针标记物。1981年，生物素标记核酸探针问世，这种通过酶促聚合反应制备的高敏感探针，用高亲和性的生物素-亲和素生物反应放大系统检测，尤其适用于普通实验室。但由于生物体内常含有内源性的生物素及生物素结合蛋白，所以生物素标记的探针会发生非特异性结合而影响检测的准确性。1984年，Tchen用半抗原AAF和A

28、AIF成功标记了核酸探针半抗原标记的核酸探针与待检靶序列核酸杂交后，半抗原会暴露出来，可以用半抗原的酶联抗体或荧光素检测，但通常需要与两个高度亲和的抗体结合，才能被检测到，且反应所需时间在2小时以上。1988年，Heiles等发展了以另一种半抗原地高辛标记核酸探针的方法，它的敏感性可与放射性同位素相媲美，而特异性优于生物素标记，且检测所需时间仅为30分钟。1.3.3.7 核酸探针的制备核酸探针的制备有以下几种方法：1.3.3.7.1 切口平移法(nick translation)又称为缺口翻译，是当前实验室最常用的标记方法之一。它是利用具有多种酶促活性的大肠杆菌DNA聚合酶I、将标记的dNTP

29、掺入到新形成的DNA链中去，从而合成高比活性的均匀标记的DNA探针。线状、超螺旋带缺口的环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。在Mg2+的存在下，先取极微量的DNA酶 I（DNase I）在DNA链上随机形成多个单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶53核酸外切酶活性，在切口处将旧链从5末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶I的53聚合催化下，顺序将dNTP连接到切口3末端的-OH上，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA单链。如果在反应中含有一种或多种标记的核苷酸(如32P-dCTP)时，则这些标记的核苷酸将代替原来的核苷酸残基，而形成放射性标记的DNA探针。1.3.3.7.2 随机引物(rand

30、om priming) 法随机引物(random priming)是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应中引物的作用。实验室中所用的随机引物可以用DNA酶 I降解小牛胸腺DNA获得。目前市售的试剂盒中的随机引物是人工合成方法得到的，寡聚核苷酸片段长度为个核苷酸残基，含有各种可能的排列顺序(46=4 096种排列顺序)。将标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段(E. Coli DNA polymerase I Klenow fragment)的催化下，进行合成与

31、探针DNA互补的DNA链。当在反应液中含有-32P-dNTP时，即形成放射性核素标记的探针。1.3.3.7.3 末端标记法(end-labelling)与切口平移或随机引物法等全长标记不同，这是把放射性核素标记在DNA片段的5端或3端的核苷酸上，因此它是一种部分标记法。由于末端标记非全长标记，标记活性较低，主要为DNA序列测定特用的方法。T4多聚核苷酸激酶能专一性地将ATP上标记的-32P转移到DNA或RNA的5-OH上。此反应可用于末端标记DNA或RNA分子，因此待标记分子一定要有5-OH。合成探针是提供5-OH的理想对象。限制性酶切片段的DNA或RNA有可能带有5磷酸基末端，因此在标记前需

32、用磷酸酯酶切除磷酸基。右图：末端标记法步骤示意图1.3.3.7.4 单链DNA探针标记法单链探针仅由特定DNA互补双链之一组成。与双链探针相比有很大的优越性，表现在：由于不存在互补链，在退火时，除与目的序列杂交外，不存在形成无效杂交的可能性（双链则有）。特别在与远源序列杂交时，如用双链DNA探针，其自身互补所形成的杂交体，比与靶序列结合的更稳定，导致检测靶序列的灵敏度降低。1.3.3.7.5 寡核苷酸探针标记法 也称为T4多核苷酸激酶标记法，由人工合成的寡核苷酸在T4多核苷酸激酶的作用下，在其5端加上一带放射性核素标记的磷酸，也可用Klenow DNA聚合酶在寡核苷酸链上进行延伸而获得高放射活

33、性的寡核苷酸探针。1.3.3.7.6 cDNA探针的标记 cDNA探针的标记并没有特别的之处，可在cDNA合成过程中引入放射性核素；在cDNA呈双链时也有用缺口平移法获得cDNA探针。1.3.3.7.7 RNA探针的标记 这是以DNA为模板在RNA聚合酶的作用下，在合成RNA的过程中引入放射性核素而获得标记的RNA探针的方法。1.3.3.8 蛋白质探针的制备蛋白质探针的制备有以下三种方法：1.3.3.8.1 荧光素标记抗体用荧光素标记的抗体在与抗原结合后可在荧光显微镜下观察，其标记方法如上所述包括酶促标记法和化学标记法等。1.3.3.8.2 酶标记抗体用酶标记的抗体与抗原结合后，酶催化底物产生

34、可被检测的反应。1.3.3.8.3 放射性核素标记抗体其原理与放射性核素标记核酸一样，在抗原与抗体结合后，通过分析放射性核素标记而定量或定性检测抗原分子。1.3.4 Southern印迹杂交1.3.4.1 Southern印迹杂交基本概念Southern印迹杂交是由Southern于1975年提出的DNA印迹转移后再行杂交分析的方法，可进行基因组DNA特定序列的定性分析。用一种或多种限制酶切割基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，按大小分离所得片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体（通常是硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片段的相对位置保持

35、不变，用放射性核素标记的DNA或RNA与固着于滤膜上的DNA杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。能产生可检杂交信号所需要的DNA量取决于多个因素，包括基因组中与探针互补的部分所占的比例、探针的大小和比活度，以及转移至滤膜上的基因组DNA的量。在最佳条件下，经放射自显影曝光数天后，这一方法的灵敏度足以检测不到0.1 pg的与高比活度的32P标记探针 109计数/(分g)互补的DNA。如果有10 g的DNA被转移至滤膜上，与数百核苷酸的探针杂交，那么经曝光过夜即可检测出在该哺乳动物基因组中只出现一次的1 000bp序列。由于信号的强度与探针的比活度成正比，与其长度成反比，所以，当用非

36、常短的探针时，Southern杂交的灵敏度可达到上限。因此要使用寡核苷酸探针得到可检信号，必须使用高比活度的标记探针，并应增加滤膜上靶DNA的量，进行放射自显影时应曝光数天。1.3.4.2 DNA的凝胶电泳1.3.4.2.1 琼脂糖凝胶电泳这是一种最常用的DNA凝胶电泳方法，影响琼脂凝胶DNA迁移速率的因素有很多，如DNA分子的大小、琼脂糖浓度（表2-12-3）、DNA构象（超螺旋环状、带切口环状及线状）、电压、电场方向、碱基组成、温度、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的种类（表2-12-4） 含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量%(w/v)线状DNA分子的有效分离范围(kb)0.35-

37、600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2 常用的电泳缓冲液 缓 冲 液 使 用 液 浓贮存液（每升）Tris-乙酸(TAE)1X: 0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA50X: 242g Tris碱 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH 8)Tris-磷酸(TPE)1X: 0.09mol/L Tris-磷酸 0.002mol/L EDTA10X: 108g Tris 碱 15.5ml 85%磷酸(1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris

38、-硼酸(TBE) *0.5X:0.045mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA5X: 54g Tris 碱 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液 *1X: 50mmol/L NaOH 1mmol/L EDTA1X: 5ml 10mol/L NaOH 2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)*TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5X溶液，出现沉淀后则予以废弃；以往都以1XTBE作为使用液(即15稀释浓贮存液)进行琼脂糖凝胶电泳，但0.5X的使用液已具备足够的缓冲容量，目前几乎所有的琼脂糖

39、凝胶电泳都以110稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用1X TBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直糟的缓冲液糟较小，故通过缓冲液的电流通常较大，需要使用1X TBE以提供足够的缓冲容量。*碱性电泳缓冲液应现用现配。1.3.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)此电泳在制作与电泳方面都比琼脂糖电泳复杂，为垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10100cm之间。Southern印迹转移将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持体（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上的方法很多，如真空转移、电转移和毛细管转移等，其中以毛细管转移应用最多，它由Southern首创，故也称Sout

40、hern印迹(Southern blot)。进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带而从凝胶转移并聚集于固相支持体表面。液体通过毛细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速率取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段右图：southern印迹基本步骤1.3.4.4 标记探针与膜上DNA的杂交这一杂交过程的实现有多种方法，既取决于探针的类型、工作条件，也取决于个人喜好。杂交需要在一定的反应系统（如甲酰胺系统）、一定的温度、一定的震荡速度、一定的漂洗条件下进行的，这是一个难以准确推算的杂交反应动力学，有时需要不断探索其条件，以获得最佳杂交效果。杂交漂洗后的尼

41、龙膜或硝酸纤维素滤膜用X片曝光，并观察X片上的杂交带。1.3.5 northern印迹杂交是RNA经过电泳后被印迹(称为northern印迹)到尼龙膜或硝酸纤维滤膜并与探针进行杂交的过程，这一过程与Southern并无什么特别的不同，只是被转移的是RNA，因此样品的准备、电泳条件、电泳装置的处理、缓冲液的组成、杂交反应动力学都与 Southern不尽相同，需要特别对待而已。右图：northern杂交基本步骤1.3.6 westhern印迹杂交1.3.6.1 western印迹杂交定义是蛋白质经过电泳被印迹(称为western印迹)到固相支持体（如硝酸纤维素滤膜）并用相应探针（如标记的抗体）进行杂交的过程。通常，蛋白质的电泳是在SDS和Laemmli不连续缓冲系统中进行的，但尚有许多其他类型的凝胶电泳也很有效。1.3.6.2 wes