西南林大现代生化仪器分析课件06高效液相色谱分析法

1、2022/9/9第六章高效液相色谱分析法一、高效液相色谱仪HPLC二、高效液相色谱法的特点feature of HPLC三、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC第一节高效液相色谱的特点与仪器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPLC2022/9/9一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph2022/9/9液相色谱仪（2）2022/9/9液相色谱仪（3）2022/9/9液相色谱仪（4）2022/9

2、/9二、高效液相色谱法的特点（HPLC） 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2022/9/9三、流程及主要部件1.流程2022/9/92.主要部件(1) 高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2022/9/94. 选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固

3、定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。*第六章液相色谱分析法一、影响分离的因素factors influenced separation二、分离类型的选择choice of separation types三、液相色谱的应用application of HPLC四、液相制备色谱preparative liquid chromatography第四节影响分离的因素与操作条件的选择high performanc

4、e liquid chromatograph factors influenced separation and choice of operation condition*一、影响分离的因素1. 影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。* 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液

5、组成、极性是改善分离的最直接的因素。* 2.流速 流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。*二、分离类型选择 choice of separation types*三、 HPLC的应用 1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50c

6、m2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。*2. 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器*四、制备型液相色谱 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超

7、载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。*2. 液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。 *3. 制备型液相色谱 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径2050mm，柱长50cm。*第六章 液相色谱分析法一、超临界流体色谱的特点与原理feature and principle of SFC二、超临界流体色谱仪的结构流程structure and general

8、process of SFC 三、超临界流体色谱的应用application of SFC第五节 超临界色谱high performance liquid chromatographsupercritical fluid chromatograph, SFC*一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.概述 超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。 超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、

9、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。*2. 超临界流体性质（1）性质介于液体和气体之间; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。（2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。 超临界流体的密度与压力有关。*3.原理 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留

10、值；*压力效应： SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）； 超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小； 压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则： C16H34的保留时间 25min 5min。*程序升压*HPLC与SFC比较*二、超临界流体色谱的结构与流程1.结构流程 *2.主要部件（1）SFC的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器

11、和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量； （2）SFC的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；*主要部件（3）流动相 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器*三、超临界流体色谱的应用1.聚苯醚低聚物的分析色谱柱：10m 63m i.d. 毛细管柱。固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2 ；柱温：120 C；程序升压；*2.甘油三酸酯的分析 四种组分仅双键数目和位置不同，难分离； 色谱柱：DB-225 SFC毛细管柱； 流动相： CO2 ；从15MPa程序升压到27MPa；2.5hr完全