西南林大生物化学仪器分析技术课件-02技术简介

1、第一节 离心分离技术离心分离技术是借助离心机旋转的离心力使不同大小和密度的物质被分离的技术。在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。一、离心机的种类与用途离心机按离心机转速的不同可分为常速(低速)、高速和超速3种。1常速离心机：常速离心机又称为低速离心机。其最大转速在8000r/min以内，相对离心力 (RCF)在1l04g以下。用于分离细胞、细胞碎片、培养基残渣、和粗结晶等较大颗粒的分离。2高速离心机高速离心机的转速为ll042.5l04r/min，相对离心力达1104105g。主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。有些高速离

2、心机装设了冷冻装置，谓之高速冷冻离心机。3超速离心机：超速离心机的最大转速达2.5l048104 r/min，最大相对离心力达5105g，甚至更高一些。超速离心机的精密度相当高。低温是必须的。另外，为了减少空气限力和摩擦，还设置有真空系统。二、离心方法的选择一般选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果若样品中存在两种以上大小和密度不同的颗粒，则采用差速离心超速离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心等。1差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。差速离心主要用于分离那些大小和密度差异较大的颗粒。操作简单、方便，但分离效果较差。三、离心

3、条件的确定影响离心分离效果的因素主要是离心机的转速和离心时间及离心介质溶液的pH值和温度。1离心力：物质颗粒在离心场中所受到的离心力的大小，决定于颗粒的质量（m)和离心加速度(ac)。Fc=mac离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径。 ac=2r转子的角速度 (rad/s)（rad弧度弧长等于半径时所对应的圆心角为1弧度，圆周的弧长为半径的2倍，即圆周所对应的角度为2个弧度） r旋转半径 (cm)若转速用每分钟转数(r/min)来表示，则: 2n/60代入上式，得到:ac=2r=42n2 r/3600相对离心力是指颗粒所受的离心力与地心引力(重力)之比。即RCF=Fc/Fg= ma

4、c/mg= ac/g =42n2 r/3600/980.6将有关数字代入上式，化简为：RCF=l.l210-5n2 r (g)式中 RCF相对离心力 (g)n一一转子每分钟转数(r/min)r旋转半径 (cm)g 重力加速度(980cm/s2)由此可见，离心力的大小与转速的平方成正比，与旋转半径成正比。2离心时间离心时间的概念，依据离心方法的不同而有所差别。差速离心时间某种颗粒完全沉降到离心管底的时间;3温度和pH值为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，必须控制好温度及介质溶液的pH值等离心条件。离心温度一般控制在4左右。在超速和高速离心时，必须采用冷冻系统。离心介质溶液的pH值应该是处于酶稳

5、定的pH范围内。 第二节 过滤与膜分离技术过滤是借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。以各种高分子膜为过滤介质的过滤称为膜分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析和电渗析等都属于膜分离技术。根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透4大类。过滤的分类及其特性类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透 20生物小分子、盐、离子反渗透膜一、粗滤粗滤可分为以下3种。1常压过滤：以液位差为推动力。 2

6、加压过滤：以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。 3减压过滤：又称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，增加过滤介质上下方之间的压差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。二、膜分离技术二、膜分离技术借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小和不同性状的物质颗粒分离的技术，统称为膜分离技术。膜分离过程中，膜选择性地让小于其孔径的物质颗粒通过，而把大于其孔径的颗粒截留。1加压膜分离以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。根据所截留的颗粒大小的不同，加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗透3种。(1)微滤微孔

7、过滤。微滤膜截留的物质颗粒直径为0.22m。主要用于分离细菌、灰尘等光学显微镜可看到的物质颗粒。在无菌水、软饮料、矿泉水等的生产中广泛应用。(2)超滤借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。超滤膜截留的颗粒直径从202000 (0.2m)。主要用于分离病毒和各种生物大分子。超滤膜一般由两层组成，表面厚度为0.15m。基层厚度为200250 m ，强度较高。使用时要将表层面向待超滤的物料溶液。超滤过程超滤过程中，小分子物质与溶剂分子一同透过膜孔渗出。不同孔径的膜有不同的透过性。膜的透过性以流率表示。孔径大，流率大。超滤时流率为0015mL/cm2min。颗粒的性状与大小，溶液浓度，操作压力，温

8、度和搅拌等条件对超滤流率也有明显的影响。影响流率的因素相对密度大、纤维状、非球状大分子及溶液的浓度高，流率低。压力增加时，超滤的流率增加。超滤时的操作压力一般控制在50700kPa。压力一般由氮气来维持。提高温度，增加搅拌速度有利于提高流率。应用超滤技术在酶工程方面的应用，不仅使酶得以分离纯化还有酶液浓缩的目的。特别注意：对于那些需要小分子辅酶的酶的生产不适用。2、 透析透析是利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜到膜外，而大分子被截留，达到分离目的。透析膜可用动物膜等制成。以透析袋形式使用。透析过程及用途透析过程：准备透析袋装样品透析收集样品。透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离

9、纯化。也可用于溶液的脱盐等。第三节 沉淀分离技术 沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其他溶质分离。 沉淀分离是酶的分离纯化经常采用的方法。沉淀分离的方法沉淀分离方法分离原理 盐析不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，添加中性盐，使酶从溶液中析出沉淀等电点等电点时溶解度最低，不同的酶有不同的等电点，通过调节溶液的pH值，使酶沉淀析出有机溶剂酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出复合在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉

10、淀，而不影响酶，从而使酶与杂质分离一、盐析沉淀法。盐溶和盐析的原理盐溶：在低盐浓度的情况下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析：当盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质和酶的溶解度又随着盐浓度的升高而减少，结果使蛋白质和酶沉淀析出。在某一浓度的盐溶液中，不同酶的溶解度各不相同。硫酸铵沉淀酶的盐析通常采用硫酸铵。优点：硫酸铵在水中的溶解度大而温度系数小 25 时，溶解度为767g/L0时，溶解度为697g/L不影响酶的活性，分离效果好价廉易得。怎样使用磷酸铵饱和度表25每升加硫酸铵的克数需要达到的硫酸铵的饱和度（） % 10 20 30 40 60 100原 0 56 114 118 767来 10

11、57 694的 90 79饱和度0每100mL加硫酸铵的克数需要达到的硫酸铵的饱和度（） % 20 30 40 60 100原 0 10.6 16.4 69.7来 10 5.3 10.9 62.7的 90 7.0饱和度盐析注意事项采用什么样的盐浓度，在实际应用时，通过试验来确定。缓慢加盐。pH值调节到所需盐析的酶等电点附近。对于温度敏感的酶，在低温下进行。 二、等电点沉淀法等电点沉淀法：酶在等电点时溶解度最低，不同酶具有不同等电点，对酶进行分离纯化的方法。原理：在溶液的pH值等于某酶的等电点时，该酶分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。在加酸或加碱调节pH值时，

12、要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱。三、有机溶剂沉淀法有机溶剂使溶液的介电常数降低。例如:20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液介电常数为40。溶液的介电常数降低，使溶质分子间的静电引力增大，溶质分子间的引力增大凝集沉淀。有机溶剂沉淀附加因素对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与溶液中的水相互作用，使分子周围的水膜破坏，也会使溶解度降低而沉淀析出。有机溶剂可能破坏酶和蛋白质的氢键等副键，使其空间结构发生某些改变，使原来在分子内部的疏水基团暴露于分子表面，形成疏水层，而使酶沉淀析出。有机溶剂沉淀的应用常用于酶沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇。有机溶剂的用量约为酶液体积的2倍

13、。例：米曲霉一淀粉酶用有机溶剂沉淀时，不同溶剂的最适浓度分别为：乙醇70%，丙酮6062%，丙醇50%，异丙醇4060%等。要注意这可能引起酶或蛋白的变性。有机溶剂沉淀法定的特点有机溶剂沉淀法析出的酶沉淀，比盐析法析出的沉淀易于离心分离或过滤不含无机盐，适用于食品工业用酶制剂的制备有机溶剂容易除去或回收容易引起酶的变性失活四、复合沉淀法方法：加入物质与酶形成复合物沉淀分离沉淀将酶从复合物中分离出来。能与酶形成复合物沉淀的物质称为酶沉淀剂。常用的有单宁和聚丙烯酸等高分子聚合物。例一、单宁作为沉淀剂将酶液调到在pH47，在酶液中单宁，使之达到0.11的浓度，形成酶与单宁复合物沉淀分离沉淀用丙酮或乙

14、醇抽提除去沉淀复合物中的单宁。此法适用于各种来源的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶等的大规模生产。例二、以聚丙烯酸为沉淀剂将酶液调pH35，加入适量的聚丙烯酸，反应生成复合物沉淀。分离出沉淀后加水调pH值至pH6以上，复合物解离。加入Ca2，Mg2、Al3等金属离子，生成聚丙烯酸盐沉淀，酶游离出来。聚丙烯酸的用量为酶蛋白量的3040%。第四节、层析技术20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，故称这种混合物分离的方法为色层分离法或色谱法(chromatography)。层析原理层析分离中一个相是固定的为固定相，另一相是流动的为流动相。当流动相流经固定相时，混合物

15、中各种物质的物理化学性质的不同，各种物质在两相中的分布程度不同，各种物质的移动速度不同，使不同物质分离纯化。层析分离设备简单，操作容易，应用广泛。酶常用吸附层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等方法进行分离。分配系数(partition coefficient)分配系数用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。在一定的温度下达到平衡后，化合物在两相中浓度的比值为分配系数，用K表示:K固定相浓度/流动相浓度有效分配系数KeffK固定相体积/流动相体积在固定相中的含量/在流动相中的含量 最高的浓度在柱的中部。化合物的有效分配系数大于1，浓度的高峰在柱的中部以上有效分配系数小于1的化合物，

16、浓度的高峰在柱的中部以下。平衡次数越多，在柱的某一位置上的化合物的浓度就越高数。层析法分类柱层析 纸层析 按操作形式分类 薄层层析 薄膜层析按两相所处的状态分类 液相层析 气相层析。吸附层析 分配层析 按层析过程的机理分类 离子交换层析 亲和层析一、吸 附 层 析原理：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中的各组分分离的方法。吸附剂：通常用于酶的吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、葡聚糖和活性炭等。操作条件：低pH值、低离子强度的条件下对酶有较强的吸附作用，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可被解吸洗脱。操作方法：可进行常规吸附柱层析，也可把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加进洗

17、脱剂。特点：吸附层析的设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，具有一定的分辨率，被广泛应用。 分 配 层 析分配层析是利用混合物中各组分在两种或两种以上不同溶剂中的分配系数不同而分离混合物中各组分的方法，相当于一种连续的溶剂抽提方法。1.原理分配层析的载体载体在分配层析中只起负载固定相的作用（不是固定相），载体是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素和滤纸等。正向与反向层析正向层析：固定相是水（包括水溶性的稀硫酸等），流动相是相极性小或非极性的有机溶剂。反向层析：固定相是有机溶剂，流动相是含水溶剂时，称为反相层析。纸层析纸层析是以滤纸为载体的分配层析，滤纸上吸附着的水(约含水2

18、0%-22%)为固定相。有机溶剂为流动相。当流动相溶剂经过样品移动，待分离物就在两相产生分配。样品中各物质的分配系数不同，就逐渐在纸上分别集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成分，随流动相移动的速度漫在流动相中分配趋势较大的成分，移动速度就快。物质的移动速率Rf值RfA/B层析液确定则物质 Rf值也恒定，可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 Rf值的决定因素是物质的有效分配系数影响Rf值的因素1、物质极性：极性大的物质其Rf值较小。2、层析溶剂：同一物质在不同的溶剂中Rf值不同。选择溶剂时应考虑被分离物质的Rf值在0.05-0.85之间。两个被分离的物质Rf值相差大于0.05。溶剂选择的原

19、则：(1)溶剂与被分离物质、多元溶剂各组分之间不起化学反应。(2)为了防止两相分层，并克服某些溶质在有机相中溶解度过小的困难，在推动剂中加入一定量的酸或碱。影响Rf值的因素3、pH：当溶剂的pH改变时,溶质的解离度随之改变,解离度越大,极性越强,Rf值越小。4、温度：温度影响分配系数、溶剂组成及纤维素的水合作用。纸层析应在恒温下进行。滤纸：对层析滤纸的要求是质地均一，薄厚适当，松紧适中，纯度高，机械强度好。 凝 胶 层 析 1、原理凝胶颗粒为多孔性网络结构。凝胶装柱构成层析床。样品加在层析床表面随溶剂下行，分子大的物质沿空隙随溶剂流动，流程短先流出层析床；分子小的物质渗入凝胶颗粒，流程长，迟流

20、出层析床。2、凝胶过滤的特点(1)凝胶过滤不变换洗脱液；。(2)实验具有高度的可重复性。(3) 温和不易引起生物样品变性失活。凝胶过滤法广泛用于蛋白质、酶、核酸等的分离纯化及测定蛋白质的分子量。凝胶的分离的分子量范围离子交换层析1 基本原理利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，使离子在层析柱中移动速度不同达到分离的目的。基本原理交换反应示意： 阳离子交换： 树脂A+B+树脂B+ A+ 阴离子交换： 树脂+A+B树脂+B + A 离子交换过程的五个步骤离子扩散到树脂的表面，快过程。离子通过树脂扩散到交换位置。在交换位置上进行交换，瞬间发生的平衡过程。被交换的离子所带的电荷越多，它与树

21、脂的结合越紧密，被取代越困难。被交换的离子通过树脂扩散到表面。洗脱液脱附，被交换离子扩散到溶液。离子交换剂离子交换剂是人工合成的高分子化合物，呈球状或无定形颗粒状。支撑物通常用纤维素、葡聚糖和琼脂糖凝胶。酸性基团、能交换阳离子阳离子交换树脂碱性基团、能交换阴离子阴离子交换剂。强酸性基团有：P、SM、SE、SP；强碱性基团有：QAE、TEAE。弱酸性基团 CM；弱碱性基团DEAE、AE常用的是CM和DEAE离子交换剂的处理与装柱新的离子交换剂水2h 倾净无离子水洗澄清 4倍体积2mol/L盐酸4h 无离子水洗至中性 2mol/L氢氧化钠浸泡无离子水洗至中性转型（阳离子交换剂用NaOH处理，转为N

22、a+型；阴离子交换剂用HCl处理成Cl 型） 装柱（均匀，无气泡，无裂纹；保持液面在交换剂平面以上）2上柱打开柱阀液体流出液面与交换剂表面平加进酶液直至交换剂的交换容量饱和为止加入适当的量的缓冲液开始洗脱3洗脱和收集上柱完毕后缓冲液洗掉未吸附的物质梯度（PH或盐浓度）洗脱液将吸附在离子交换剂上的离子按亲和力由小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集。离子交换剂的再生及保存再生处理：含杂质较少时，用酸、碱或盐进行转型即可。含杂质较多时，要先经过酸（对阴离子交换剂）或者碱（对阳离子交换剂）浸泡清洗，用水洗至中性，然后再转型。20%的乙醇保存。亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，

23、而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等。亲和层析的四个要素常用的亲和介质及专一性配体根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析 上柱用柱层析。在吸附时，平衡缓冲液的组成、pH值和离子强度应选择亲和作用最强、最有利于形成复合物的条件。根据生物大分子的特点，选取接近中性pH，样品液和平衡缓冲液一致。亲和吸附常在4下进行，以防止生物大分子热变性失活。 洗脱1、用平衡缓冲液洗去杂质。2、用洗脱液洗脱样品。此洗脱条

24、件与亲和吸附时相反，洗脱束缚蛋白质的方法有两种:用含有较高亲和力物质的洗脱液。改变复合物的环境（pH、离子强度、温度）使之解离。不能使酶失活，用弱酸或弱碱。不得已时可采用盐酸胍、尿素和强酸之类的酶变性剂洗脱，洗脱后再想法使之恢复活性。保存柱洗脱结束后，亲和柱继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物时为止。再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，存放于防菌污染的冰箱或冷室(低于4)中，备用。高效液相色谱高效液相色谱(high performance liquid chromatography)，又称作高压液相色谱(high pressure liquid chromatography)简称HPLC。凝胶、疏水性、

25、反相、离子交换、亲和。 高效液相色谱仪的组件溶剂槽、高压泵、分析柱、进样器、检测器、部分收集器、记录仪、数据处理机等 高效液相色谱的特点及应用具有普通液相层析的功能，又有气相色谱的特点(即高压、高速、高分辨率和高灵敏度)适用于很多物质(如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等)的分析和制备。 FPLC近年来出现一种与HPLC相近的快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography，简称FPLC)与HPLC不同点：1、管道是塑料2、中压第五节 电泳分离技术带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳

26、。生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒，例如，蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有可解离的氨基(一NH3)和羧基(一COO)，是典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电。它们在电场的作用下会产生电泳现象。电泳分离蛋白的机理溶液的pH与蛋白质的等电点(pI)一致时，蛋白质质点在电场中不移动溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出H而带负电，蛋白质分子在电场中向正极移动溶液的pH值小于pI，则蛋白质分子结合一部分H而带正电，蛋白质分子在电场中向负极移动。电泳分离蛋白的历史和现状20世纪60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，并发展了SDS-聚丙烯

27、酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。电泳技术的应用很广泛，特别是对蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定。是生化分析分离不可缺少的一门重要技术。电泳泳动速度带电颗粒的泳动速度用迁移率来表示。迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，可用下式表示： m=v/E=Q/6rm：迁移率（cm2/Vs）；v：颗粒泳动速度（cm/s）；E：电场强度（V/cm）；Q：被分离物所带净电荷；：介质粘度；r：颗粒半径。影响迁移率的主要因素电场强度溶液pH溶液的离子强度温度电场强度电场强度是指每厘米支持物的电位差，电场强度越高，带电颗粒泳动越快。常压电泳电场强度为210V/cm高压电泳： 70

28、200V/cm溶液pHpH决定带电颗粒的解离程度，在距样品等电点pI越远的pH溶液中，样品所带的电荷量越多，泳动速度越快；反之，则越慢。为使pH恒定，必须选用适当的电极缓冲液；为了使被分离的蛋白质混合物所带的电荷数量有较大的差异，有利于彼此的分开，应选择一个合适的pH，溶液的离子强度（ionic strenght)缓冲液离子强度过大，溶液中的离子会分担大部分电流，而使被分离的粒子迁移速度变慢。一般最适的离子强度在0.020.2mol/L之间。温度的影响电泳时，由于通电引起温度升高，致使介质粘度下降，迁移率增加。电泳需要控温，方法是：1、控制电压或电流2、将电泳槽置冰箱里进行电泳3、电泳系统中安

29、装冷却散热装置。凝 胶 电 泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法。此法在分子生物学、生物化学以及临床等方面具有广泛的应用。PAGE的优点(1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的多聚体。调节单体浓度或单体和交联剂的比例，能得到孔径不同、范围广泛的凝胶物质，适应性强且重复性好。(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，对温度和pH变化不敏感。(3)聚丙烯胺酰凝胶是CCCCC连接的多聚体，侧链除带有不活泼的胺酰基外，不带有任何其他离子基团，故无电渗作用。(4)聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，弹性大，无

30、色透明，有利于电泳后进行各种处理。(5) 样品量少(1g)，分辨率较高。在催化剂过硫酸铵ammonium persulfate (NH4) 2S408 ,简称AP和加速剂N，N，N，N一四甲基乙二胺(N，N，N，N一tetramethyl ethylene diamine，简称TEMED)的作用下，聚合含酰胺侧链的脂肪族长链，相邻的两个链由甲叉桥连接起来的三维网孔结构。聚丙烯酰胺凝胶的聚合 在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下，发生聚合反应凝胶浓度和交联度的确定凝胶的孔径取决于胶的浓度和交联度。凝胶浓度: T(A+B)/M100% Acr (g)；Bis (g);M (mL)。 交联度: C=B /(A+B)l00% T为2%5%时, A/B20，T为5%10%时， A/