动物细胞工程动物细胞的大规模离体培养技术课件 高中生物竞赛

1、动物细胞的大规模离体培养技术一、动物细胞大规模培养概述（一）动物细胞大规模培养技术的概念 指在人工条件（除满足培养过程必需的营养要求外，还要进行pH和溶解氧的最佳控制）下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology） 人工条件下，动物细胞在反应器中进行大量地、高密度培养，以生产珍贵生物制品的技术。 pH温度溶氧发酵工艺等条件发展简史1907 Harrison创立了体外组织培养技术； 1951 Earle开发动物细胞体外培养合成培养基；1957 Graff应用灌注技术，培养密度达1010个

2、/L；1962 Capstick成功实现小鼠肾细胞的大规模培养，标志着动物细胞大规模培养技术的开始；1967 Van Wezel成功地以DEAE-Sephadex A50为载体，实现动物细胞的载体培养；1975 Kohler和Milstein成功建立单克隆抗体技术；1975 Sato用激素代替血清使垂体细胞株在无血清介质中生长成功，预示无血清培养的诱人前景；1986 Deme Biotech公司首次成功地用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体；1989 Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制技术，更新培养工艺的优化控制理论。发展简史动物细胞培养技术应用

3、 疫苗生产上的应用 已实现商业化生产的产品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、骨髓灰质炎病毒疫苗、牛白血病疫苗 干扰素生产上的应用 自1957年发现干扰素以来，经历了自然干扰素、基因重组干扰素和蛋白质工程干扰素等3个发展阶段。英国Wellcome公司为了满足临床实验的需要，采用8000L Namalwa细胞生产干扰素。 DMEM培养基胎牛血清其他成分锥形瓶逐级放大培养加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口收获病毒Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺单克隆抗体生产上的应用 应用动植物细胞生产单克隆抗体是一条经济、可靠的途径。 英国Celltech公

4、司采用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体；国内也已成功地应用中空纤维培养系统和微载体培养动物细胞生产单克隆抗体作为血型定型试剂。 其他基因重组产品生产上的应用 细胞能精确地转录、翻译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质；可以简化蛋白质的分离提纯；美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生长激素等。 动物细胞大规模培养的一般工艺流程1 组织块；2组织块碎片；3消化；4离心；5原代培养；6传代培养；7液氮罐保存细胞；8复苏培养；9扩大培养；10大规模生物反应器培养二、动物细胞大规模培养的方法 根据动物细

5、胞的培养特性不同，可采用悬浮培养、贴壁培养和固定化培养三种培养方法进行大规模培养。1、悬浮培养 指细胞在生物反应器中自由悬浮生长增殖的培养方法。 主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。悬浮培养的优点： 操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧效果比较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可以借鉴许多细菌发酵的经验。悬浮培养的缺点： 不能采用灌流培养，导致细胞密度较低，另外只有少数细胞适合悬浮培养。搅拌式生物反应器气升式生物反应器2、贴壁培养 指细胞贴

6、附在一定的固相表面进行的培养。 目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体等。其中微载体培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术。贴壁培养的优点： 容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、适用于所有类型细胞。贴壁培养的缺点： 扩大培养比较困难，投资大，占地面积大；不能有效监测细胞的生长。3 2 旋转瓶培养14 中空纤维培养 细胞工厂培养 微载体培养目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体等。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点（1）旋转瓶培养 细

7、胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。细胞在体内、体外的生存空间：存在差异三维空间，高密度生长二维空间，单层生长，生长密度低体内体外（2）中空纤维培养 中空纤维培养技术模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细血管”即中空纤维来为细胞提供物质代谢条件。 中空纤维是细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，水分子、小分子营养物质和气体可以通过。管壁表面有许多海绵状多孔结构，细胞能在上面贴壁生长。 细胞接种到中空纤维的外表面，而充氧的培养液灌流到中空纤维的内腔。贴附在外表面的细胞吸取内腔渗出的营养，迅速生长繁殖。一段时间后细胞占据

8、中空纤维外壁所有空间，并在纤维表面堆积。（3）细胞工厂培养由一组长方形培养小室组成。(a)向培养室内灌注培养液，培养液在各培养小室之间流动 ；(b)细胞工厂转动90。，每个培养小室液体被分隔，气相仍到达各个培养小室；(c)向下放平，封闭入口，或者连接到5CO2通气管上（4）微载体培养微载体（Microcarrier）：是直径60-250m的适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。良好微载体的特点：1、好的生物相容性：无毒无害；2、好的黏附性：适于细胞附着、伸展和增殖，一般带正电荷；3、大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一； 4、良好的传质性能；5、强的机械性能：

9、保护细胞、重复利用；6、好的热稳定性：适合高压蒸汽灭菌。微载体培养的操作过程： 微载体培养动物细胞也经过以上四步。大致可以分为五个阶段，即培养初期阶段、黏附贴壁阶段、维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大阶段。培养初期阶段：保证培养基与微载体处于稳定的p和温度，对数生长期细胞接种至1/3体积的培养基中。黏附贴壁阶段：缓慢加入培养液至工作体积，增加搅拌速度保证完全均质混合。维持培养阶段：随细胞增殖，微球变重，增加搅拌速率。经过3天左右，培养液呈酸性，需换液。细胞收获阶段：排干培养液，缓冲液漂洗1次，加入酶，快速搅拌，解离收集细胞及其产品。微载体培养的放大阶段：增加微载体的含量或培养体积进行

10、放大。微载体培养的优点：1、表面积体积大 ，单位体积培养液的细胞产率高。2、把悬浮培养和贴壁培养融合， 兼有两者的优点。3、可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况。4、培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。5、接种与收获方便，可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。微载体培养的缺点： 细胞生长在微载体表面，培养过程中连续搅拌会损伤微载体表面的细胞，而且培养后期细胞容易从微载体上脱落下来。 为克服传统的实心微载体的不足，现开发出大孔微载体。大孔微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在其内部生长，保证细胞充分的生长空间，使细胞免受机械损伤，增加细胞贴壁的

11、稳定性。3、固定化培养 将动物细胞与水不溶性载体结合起来再进行培养的方法。 具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。 在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如吸附培养法、包埋培养法和微囊培养法。三、动物细胞大规模培养反应器类型满足：低剪切力、良好的混合状态、合适氧浓度、等。 20世纪70年代以来，动物细胞大规模培养用生物反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模越来越大。 动物细胞培养用生物反应器类型 悬浮培养反应器贴壁培养反应器包埋培养反应器搅拌反应器搅拌反应器（微载体培养）流化床反应器气升式反应器玻璃珠床反应器固定床反应器中空纤维反应器

12、中空纤维反应器陶质矩形通道蜂窝状反应器陶质矩形通道蜂窝状反应器动物细胞培养反应器1、搅拌罐式生物反应器 与传统的微生物反应器相类似，只是根据动物细胞培养的特性，作适当的调整。要求搅拌器转动时产生的剪切力小，混合性能好，同时通气培养过程中尽量减小操作对细胞的损伤程度而又能达到充足供氧的目的。 2、气升式生物反应器 自1979年Katinger等首次用气升式生物反应器成功地进行了动物细胞的悬浮培养以来，气升式生物反应器在动物细胞大规模培养中的应用一直是生物工程学家关注和热衷的焦点。 3、中空纤维生物反应器 中空纤维生物反应器是个特制的圆筒，圆筒里面封装着数千根中空纤维。纤维是一种细微的管状结构，类

13、似于动物组织内的毛细血管，中空纤维的外径一般为100500um，管壁厚度约5075um，管壁是极薄的半透膜，似海绵，富含毛细管。在中空纤维生物反应器中就形成了两个空间：一是“内室”，即纤维管内空间，可灌流无血清培养液供细胞生长；二是“外室”，即纤维管与管之间的间隙；细胞接种到外室，细胞贴附在外室的管壁上，并迅速吸取从内室渗透出来的养分，迅速生长繁殖。 中空纤维反应器具有无剪切力和高传质等优点。 中空纤维生物反应器的总体发展趋势是让细胞在管束外空间生长，以达到更高的培养细胞密度。中空纤维材质可以是纤维素、改性纤维素、醋酸纤维、聚丙烯、聚砜、铜氨人造纤维、聚甲基丙烯酸甲酯及其他聚合物。 大规模HE

14、K293细胞发酵培养 重组腺病毒的纯化 实时HPLC质量监测技术四、大规模细胞培养技术的操作方式1、分批式培养2、流加式培养 3、半连续式培养4、连续式培养 5、灌注式培养1、分批式培养 将细胞和培养液一次性转入生物反应器内，培养过程中体积不变，不添加其他成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基。 2、流加式培养 将终体积1/31/2的培养液装入反应器中，适宜条件下接种细胞，培养过程中流加浓缩的营养物或培养液，使细胞持续生长至较高密度、目标产品达到较高水平。 采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞。 3、半连续式培养 也称为重复批式培养或换液培养。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间取出部分培养物，再用新培养液补足到原有体积，维持反应器内总体积不变。特点：（1）培养物的体积逐步增加； （2）可进行多次收获； （3）细胞可持续指数生长，保持产物和细胞在较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间。4、连续式培养 将细胞接种于一定体积的培养基，细胞达最大密度之前，以一定速度连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积恒定。 细胞可在稳定状态下生长，环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH可恒定，可有效延长细胞的对数生长期。5、灌注式培养 细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增