动物细胞工程第三节 肿瘤细胞的培养课件 高中生物竞赛

1、第三节 肿瘤细胞的培养可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化学和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理。可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。研究周期短，比较经济。应用细胞培养进行肿瘤研究优点如下: 1.形态和性状 2.生物特性 3.永生性 4.侵润性 5.异质性 6.细胞遗传性一、肿瘤细胞培养的生物学特性肿瘤细胞形态不规则，细胞界限清晰；核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤

2、细胞具有不定向运动和粘附不依赖性有关。1.形态和性状电镜下的Hela细胞在无血清或低血清(2%5%)时仍能生长，营养要求不高；在软琼脂培养时单个细胞能形成集落；生长方向性消失，失去接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长；细胞饱和密度大，分裂指数高，细胞倍增周期短。2.生物特性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代；体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控；恶性肿瘤多数在体外培养时并不容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，永生性可在体外培养后获得。3永生性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵

3、润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。4侵润性加入50um药物Baicalein处理迁移-划痕实验(wound healing assay)细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。侵袭-Transwell assay将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，可以研究上下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响内置杯单层细胞通透膜上室下室5异质性 肿

4、瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖。6细胞遗传性 体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈异倍体或多倍体，常有非整倍染色体出现。区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞的常用指标续表3二、培养肿瘤细胞的生物学特性的检测体外培养的肿瘤细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列的细胞生物学特性鉴定。目的在于：证明培养的细胞是否来自原来的肿瘤细胞。 说明肿瘤组织类型。 描述肿瘤细胞的生物学特性。通常要检查下列项目：1.组织起源：应说明培养材料起源于哪个胚层

5、、器官组织、什么样供体、何种疾病等，必要时要提供病理诊断鉴定资料。2.形态观察：观察细胞一般形态如细胞形状，核浆比例倒置，有丰富的三极或多极有丝分裂，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱。3.细胞生长特点： 检测细胞生长曲线，细胞分裂指数，倍增时间及细胞周期。癌细胞失去正常的接触抑制，呈多层生长，生长旺盛，倍增时间缩短，饱和密度大，分裂指数较高，具无限增殖能力，细胞浸润能力较强等。4.软琼脂培养： 癌细胞在低密度下仍具有高度存活率，并在软琼脂中形成集落。5.细胞核型分析： 检测核型特点，染色体数量，有无标记染色体，染色体带型等，癌细胞大多为异倍体，多倍体，并有标记染色体。6. 动物致瘤试验：裸鼠

6、背部皮下接种1109 2109/L癌细胞能生长形成实体瘤，其组织学形态与原发瘤相似。7.组织化学检查：癌细胞中脱氧核糖核酸、酸性磷酸酶和磷脂增多，碱性磷酸酶下降，乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性也改变。8.其他生物学特性检测：凝集试验等。动物致瘤实验肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPM1640，DMEM、Mc-Coy-5A等培养基，10%血清即可，在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清(1%2%)以利细胞生长。培养方法，主要有组织块法、酶消化法、脱落细胞法等。(二)肿瘤细胞的培养方法细胞系(株)污染情况鉴定(1)病毒鉴定：如EB病毒的核心抗原(EBNA)可在许多B淋巴细胞系、宫颈癌、鼻咽癌及白血细胞系中检出。(2)支原体检查： (3)细胞系(株)交叉污染的鉴测：细胞系(株)交叉污染的鉴测：遗传学上用检测人Y染色体、染色体Q带、G带核型分析。免疫学上鉴定人类细胞HLA或免疫细胞分析。生物化学上鉴定同功酶的种特性及多态酶的表型差异性。 来源于患者肿瘤组织的异种