snp分型解析专题知识培训

1、SNP分型冯 静.06.19snp分型解析专题知识培训第1页主要内容SNP相关知识SNP检测方法snp分型解析专题知识培训第2页什么是SNP？SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) ，单核苷酸多态性。是基因组核苷酸水平上由单个核苷酸变异引发DNA序列多态性。包含单碱基转换、颠换、插入、缺失，其中最少一个形式在群体中频率大于1。转换：嘧啶和嘧啶之间或者嘌呤和嘌呤之间交换（AG，CT)颠换：嘧啶和嘌呤之间交换(A/G C/T)snp分型解析专题知识培训第3页从理论上来看，每一个SNP 位点都能够有3 种不一样变异形式，形成转换和颠换两种变异，二者之比为2:1。S

2、NP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T(CG中C常为甲基化，自发地脱氨后即成为T)。snp分型解析专题知识培训第4页SNPs in Human Genome人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上SNPs。SNP是人类可遗传变异中最常见一个，占全部已知多态性90%以上。大多数SNPs是单纯多态性，但也有一些与疾病发生相关联，是决定人类疾病主要遗传基础。snp分型解析专题知识培训第5页正常血红细胞镰刀状血红细胞携带氧气能力降低，因而出现贫血症状 谷氨酸缬氨酸镰刀状细胞贫血snp分型解析专题知识培训第6页不一样人群中SNP频率分布有差异，而这些差异能

3、够代表某一人群遗传差异。SNP研究将帮助我们寻找新遗传病致病基因或易感基因，认识人种、人群、个体间遗传差异，疾病与个体差异关系，以及个体差异对药品耐药性存在不一样反应能力。SNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，是说明基因组功效及特点主要基础。snp分型解析专题知识培训第7页HapMapProject SNPs单体型图（HapMap）：人类DNA序列中多态位点常见模式图。目标：建立一个无偿向公众开放关于对人类健康和疾病以及对药品和环境反应有影响相关序列变异关键信息。确定超出一千万人类基因组SNPs，完成了约310万SNPs（5）在270个样品中分型。Yorubans-Ibadan,

4、 Nigeria, Africa (YRI) Caucasian -North & West Europe ancestry; Utah, USA (CEU)Japanese -Tokyo, Japan (JPT)Chinese -Han Chinese; Beijing, China (CHB)snp分型解析专题知识培训第8页SNP研究策略全基因组研究（发觉/筛选）精细定位（验证）候选基因/临床研究大样本分型高通量中通量低通量snp分型解析专题知识培训第9页SNP研究技术路线数据分析参考国外文件一样课题研究结果首选外显子和开启子关联分析单倍体型分析对目标基因特殊位置测序检测是否有新SNP位点

5、寻找tagSNP二代测序数据Illumina Bead ArrayAffymetrix SNP 6.0筛选候选SNP区域确定SNP候选区域候选SNP大样本分型定位致病基因易感基因TaqmanSNaPshotSequenomsnp分型解析专题知识培训第10页SNPs检测技术区分SNPs位点的原理方法基于杂交基于酶或PCR以构象为基础直接测序数据的检测分析手段凝胶分析技术荧光检测技术DNA芯片质谱检测技术测序、质谱、TaqMan、SNaPshot、HRM、Illumina芯片、SNP检测技术snp分型解析专题知识培训第11页1 直接测序法客户指定检测SNP位点每个位点均需经过PCR扩增然后测序能发

6、觉已知和未知SNP位点操作简单，但工作量大，成本较高适合用于少数几个位点及样本检测AGprimerLprimerRsnp分型解析专题知识培训第12页2 Taqman 探针法针对每个SNP位点设计一对Taqman探针，用不一样荧光标识。5 末端携有汇报荧光基团, 3端标有荧光淬灭基团Tag 聚合酶含有外切活性snp分型解析专题知识培训第13页经过散点图显示结果每个数据集代表一个基因型： 纯合子、杂合子和无模板对照（NTC）snp分型解析专题知识培训第14页探针法特点准确度高速度快、通量大适合已知SNP位点，位点数量少，多样本（几千个）检测snp分型解析专题知识培训第15页3 SnaPshot方法

7、单碱基延伸原理：在一个含有测序酶，四种荧光标识ddNTP,紧挨多态位点5端不一样长度延伸引物和PCR产物模板反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。 snp分型解析专题知识培训第16页同一位点不一样等位基因区分 依据峰颜色可知掺入碱基种类不一样位点之间区分依据峰移动胶位置确定该延伸产物对应SNP位点。snp分型解析专题知识培训第17页操作流程目标区段扩增PCR产物纯化SNaPshot反应ABI3730测序仪检测snp分型解析专题知识培训第18页单重位点检测GGGAAAAAsnp分型解析专题知识培训第19页SnaPshot多重位点检测不一样位点引物带不一样长度尾巴颜色代表不一样基因型大小代表不一样位

8、点不一样大小扩增产物snp分型解析专题知识培训第20页技术特点分型准确多位点同时检测，每个反应可检测8-12个位点，适宜检测位点数为8-50个不受SNP位点多态性限制适合用于多位点同时检测，样本数不受限制，能够是几十到几千snp分型解析专题知识培训第21页4 HRM(高分辨率熔解曲线分析)在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测荧光信号，荧光值随温度改变即熔解曲线。DNA都有其独特序列，包含长度、GC含量及碱基互补性差异，这么每个DNA片段都有独特熔解曲线形状。依据曲线能够准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。snp分型解析专题知识培训第22页HRM特点染料：饱和性染料，如LC

9、 Greensnp分型解析专题知识培训第23页仪器：在熔解曲线阶段，含有细微温度差异高捕捉率常规熔解曲线温度捕捉范围：0.2-0.5度高分辨率熔解曲线温度捕捉范围：0.1-0.02度snp分型解析专题知识培训第24页检测原理snp分型解析专题知识培训第25页snp分型解析专题知识培训第26页技术优势无需序列特异性探针操作简便快速，成本低可对未知位点进行筛查较高通量snp分型解析专题知识培训第27页5 质谱检测（Sequenom）质谱仪经过对物质分子量（质荷比）进行检测，到达区分、判别物质目标。SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，经过试验将差异放大，然后以质谱仪进行检测即可。snp分型解析

10、专题知识培训第28页+Enzyme+ddNTPAGAllele 1Unlabeled Primer (23-mer)TAllele 2Unlabeled Primer (23-mer)CExtended Primer (24-mer)TExtended Primer (24-mer)Csnp分型解析专题知识培训第29页质谱法优点准确：检测分子本质特征之一分子量，没有其它标识；灵敏：pmol物质即可被检测出；通量高：2周最高可完成7万个反应；灵活：以384板形式，最高可至17重反应，不论样本和位点多少，都能灵活处理；廉价：引物常规长度，不带标识，多重反应，位点越多越廉价；污染小：一管式操作，反应

11、体系在试验时一直在一个试管内。snp分型解析专题知识培训第30页6 Illumina SNP芯片snp分型解析专题知识培训第31页九月 22Illumina SNP应用策略Infinium Whole Genome Genotyping 全基因组检测适合用于 GWAS、CNV 研究项目每张芯片有660K，1M ，2.5M，5MSNP位点数据库：HapMap Phase 1-3和1KPG(千人基因组计划）GoldenGate 特定SNP位点检测适合用于用户定制SNP研究（每个芯片可研究48-3072 SNP位点）Linkage 连锁分析（Human and Mouse)主要组织相容性（MHC）研

12、究Panel肿瘤SNP芯片snp分型解析专题知识培训第32页当前主流分型芯片Infinium II AssayHuman660W和Omni1，Omni1S，Omni2.5，Omni2.5S，Omni5以HapMap1-3期数据库和1KGP数据库Infinium 全基因组分型芯片snp分型解析专题知识培训第33页Infinium II Assay单碱基延伸Two haptens/colorsAWGA targetBead T C TTGGTGEx: SNP= rs123456GWGA targetA/GWGA targetA/GWGA targetsnp分型解析专题知识培训第34页九月 22当前

13、主要产品人全基因组分型芯片：Human660W，HumanOmni1，HumanOmni1S，HumanOmni2.5，HumanOmni2.5S，HumanOmni5，中华牛高密度全基因组分型芯片（BovineHD ，777962位点)犬全基因组分型芯片（Canine SNP20,22362位点）犬高密度全基因组分型芯片（ CanineHD,170000左右位点）马全基因组分型芯片(Equine SNP50,54602位点）羊全基因组分型芯片(Ovine SNP50,54241位点）猪全基因组分型芯片(Porcine SNP60,62163位点）玉米全基因组分型芯片(Maize SNP50,

14、56110位点）snp分型解析专题知识培训第35页用户自定义SNP位点检测GoldenGate检测低中通量可依据研究需要挑选SNP位点，制作探针组芯片规格：48, 96,384,768 ,1536,3072 位点可选样本数为480倍数snp分型解析专题知识培训第36页九月 22AGillumiCode AddressAllele Specific Extension &LigationUniversal PCR Sequence 1Universal PCR Sequence 2Universal PCR Sequence 3GoldenGate 检测-等位基因特异性延伸和连接Genomic

15、DNAT/CLigaseT/APolymerase特定SNP位点检测snp分型解析专题知识培训第37页九月 22AillumiCode #561Amplification TemplatePCR with Common PrimersGoldenGate 检测-扩增Cy3 Universal Primer 1Cy5 Universal Primer 2Universal Primer P3snp分型解析专题知识培训第38页九月 22/illumiCode #561illumiCode #217illumiCode #1024GoldenGate 检测-和独特带 IllumiCodeTM 编码序

16、列芯片杂交/A/AG/GC/TSNP #561SNP #217SNP #1024snp分型解析专题知识培训第39页GoldenGate技术snp分型解析专题知识培训第40页九月 221536 位点 384 DNA样品试验数据snp分型解析专题知识培训第41页肿瘤相关 SNP 芯片（Cancer Panel） 选择约 400 个肿瘤相关基因 1400 个 SNP 标识，信息起源于美国 NIHSNP500 肿瘤数据库 / 。主要组织兼容性研究芯片（ MHC Panel ） MHC(Major Histocompatibility Complex) 主要组织相容性区域是一段 4Mb 基因组序列，位于 Chr 6p21 上，包含了 160 个基因。这些基因中有 40% 与免疫蛋白编码相关，其中也包含了白细胞抗原基因等。 MHC 芯片针对这一区域挑选了 2,400 个平均间隔 2kb SNP 标识，对该区域 SNP 进行检测。 MHC 芯片可广泛应用于免疫、移植、疾病等相关研究。snp分型解析专题知识培训第42页Affymetrix SNP Array 6.0涵盖超出1,800,000个遗传变异标志物：包含超出906