基因工程DNA重组课件

1、1第一节 DNA重组的基本原理第二节 工具酶第三节 DNA分子的片段化第四节 DNA片段的体外连接第二章 DNA重组2生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程与发酵工程等。目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ； 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。第一节 DNA重组的基本原理3应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转

2、化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA重组原理4DNA重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。重组DNA质粒DNA基因片段5发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 同源重组6 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 DNA连接酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶第二节 工具酶7一把特殊的剪刀限

3、制性内切酶的发现 阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖。10DNA限制性内切酶112. 性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。3. 功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1. 来源12I 型限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。（二）限制性内切酶的类型II 型限制性内切酶 III型限制性内切酶 16首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。（1）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. I型限制

4、性内切酶 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。17需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点18首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。2. II型限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 。19CTGCAG 3 端凸出（如Pst I切点）GACGTC5 -3 3 -5 5 -3 3 -5 CTGCA

5、 G G ACGTC23 连接便利（4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。2425 补平成平齐末端凸出的3 端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 5末端标记凸出的5 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。26识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers) 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如Hind 和Hsu I。Hind 5 -AAG

6、CTT-3 3 -TTCGAA-5 Hsu I 5 -AAGCTT-3 3 -TTCGAA-5 27GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst2829Xma I 5 -CCCGGG -3 3 -GGGCCC-5 Sma I 5 -CCCGGG-3 3 -GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：30识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等（6）同尾酶(Isocaudamers）5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5

7、 BamH IBcl I5 -TGATCA-3 3 -ACTAGT-5 5 -AGATCT-3 3 -TCTAGA-5 Bgl 5 -UGATCY-3 3 -YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。31限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。（7）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性34EcoR I和BamH I等都有*活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：使用的时

8、候要特别注意！353. 型限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG36核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ATP、 Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）Eco

9、P1:AGACCEcoP15:CAGCAG37切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端2426bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用381973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：（三）限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Ha

10、emophilus influenzae）用Hin表示。394. 限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马数字表示。如EcoR I，EcoR V。40第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株

11、的第三种酶41DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1. DNA的纯度 （四）影响限制性内切酶活性的因素纯化DNA加大酶的用量延长保温时间 扩大反应体积（ 20l）一般采取42大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCATGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。43不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求25-65 oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApa IBcl IMae IITaq I30505065Apy IBst

12、E IIMae III306055Ban IMae ISma I5045253. 温度 44是影响限制酶活性的重要因素。4. 缓冲液(Buffer) 缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl： 维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。45（五）限制性内切酶对DNA的消化1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG46内切酶在DNA上的所有识别位点都被

13、切开。2. 完全消化 1234123447只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。3. 局部消化 12341448大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。4. 限制酶酶切反应的终止 5. 几种常用限制酶识别位点4950（一）基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2. Klenow fragment3. T7 DNA聚合酶4. T4 DNA聚合酶5. 修饰过的T7 DNA聚合酶6. 逆转录酶7.Taq DNA聚合酶二、DNA聚合酶511. 共同特点把dNTPs连续地加到引物的3OH端。2. 主要区别T7 DNA聚

14、合酶可以连续添加上千个dNTPs而不从模板上掉下来。有几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。（二）常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。52DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高3. 常用DNA聚合酶的特性比较53（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的DNA探

15、针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质一条单链多肽。5 3 外切酶活性位于N端。用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5 3 外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。54 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有3OH游离端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件-OH5 3 dNTPs55标记 核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I 制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交56标记已知序列的核酸片断 探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放

16、射性的已知序列的核酸片断5 3 57 DNA聚合酶I 对探针序列的标记切口转移法(nick translation )：放射性同位素标记：DNA聚合酶I 同时具备5 3 外切酶活性和5 3 的聚合酶活性（以及3 5 外切酶活性）。585 3 外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5 端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3 一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 59纯化的DNA片断DNase I 制造单链切口DNA Pol I 进行切口转移一种-32P-dNTP5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dN

17、TP从头至尾都被标记602. Klenow fragment具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性质DNA Pol I Klenow fragment (76KD）枯草杆菌蛋白酶61 3端补平55klenow DNA 3末端标记补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途623隐蔽末端的DNA片断Klenow fragment补平根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-GAATT33-CT

18、TAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h63 cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow533553引物64（1） T4 DNA聚合酶的性质3. T4 DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。 来源 酶活性65 特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。6655335533T4 DNA聚合酶无dNTPsT4 DNA聚合酶

19、有dNTPs5567（2） T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端 DNA 3末端标记68酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切）DNA酶切片断T4 DNA聚合酶（53聚合）55335533553355335533内切酶切无dNTPs694. T7 DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53聚合酶和35外切酶活性。

20、 大肠杆菌编码的小亚基：增加大亚基对模板的亲和性。70（2）T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 35外切酶活性高单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。71 进行末端标记 以大分子量DNA为模板的合成如M13 补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途取代合成法标记3末端。与T4 DNA聚合酶相同。合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。725. 修饰后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 DN

21、A测序：双脱氧法； 标记DNA 3隐蔽末端； 更有效地补平末端。736. 逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成。74 链有反转录活性和 RNaseH活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA75（3）逆转录酶的用途 链RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。 合成cDNA以oligo d

22、T为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT53mRNA 5cDNA76 合成DNA探针用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。7. Taq DNA聚合酶77（一）末端脱氧核苷酸转移酶1. 来源小牛胸腺。2. 组成大小两个亚基。3. 特性（1） 53DNA聚合酶活性（terminal transferase）三、DNA修饰酶78 不需要模板！ 需要3OH、二甲砷酸缓冲液。 底物可以是单链DNA、 是3OH突出的双链DNA。 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA 53TTTd

23、TTP ，末端转移酶79（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA55Hind酶切ATTCGAAGCTT AKlenow补平80AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA AGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA81（3）非放射性标记DNA片断的3端AAGCTTTTTTCGA AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHind位点Hind位点连接催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。82（二）T4多核苷酸激酶1. 来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能催化磷

24、酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。8353HO-OH53HO-OH3P-OH53HO-P5ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。843. 多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。53HO-OH53HO-OH332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP多核苷酸激酶3P-OH53HO-P5碱性磷酸酶（1）正向反应（forward reaction）85（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端

25、的磷酸交换。3P-OH53HO-P5332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。86 （三）碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。872. 碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3P-OH53HO-P553HO-OH53HO-OH碱性磷酸酶3. 碱性磷酸酶的功能（1）防

26、止线性化的载体分子自我连接88单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHind酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶55589A-OHTTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。9091ATTCGAAGCTT AAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3P-AGCTTA-OH53HO-ATTCGA-P5外源DNA92从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起

27、的酶。（一）DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。四、DNA连接酶93（1）大肠杆菌连接酶1. 两种DNA连接酶只能连接粘性末端。（二）DNA ligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。94（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中： NAD+2. 连接条件951. ATP（NAD+)提供激活的AMP。（三）连接反应的机理2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3. AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-C

28、H2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi964. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP975. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。98连接酶反应的最佳温度是37C。（四）连接反应的温度1. 最佳温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。2. 实用温度所以一般采用 416 C。99增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1. 插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度4。（五）影响连接反应的因素1020倍。100101102 是一类从多核苷酸链的

29、一头开始催化降解核苷酸的酶。（一）单链DNA外切酶1. 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）53外切识别5-OH2. 大肠杆菌核酸外切酶（exo ）53、35外切识别3-OH、5-P五、核酸外切酶（ Exonucleases）103（二）双链DNA外切酶1. 核酸外切酶（exo ）35外切识别3-OH主要用途：在DNA双链的末端产生出单链区域。5555exo 与klenow配合进行3端标记-OHHO-1042. 核酸外切酶（ exo）53外切。主要用途：使DNA双链变成单链（短）。5 P-P 555 exo 成为测序模板。识别5-P（但不能降解5-OH）105（一）S1核酸酶1. 来源稻谷曲霉（

30、Aspergillus oryzae）。2. 特性（1）高度单链特异性（2）反应条件 低水平Zn2+ pH4.04.3六、单链DNA内切酶1063. S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。S1S1发卡或有缺口的部位。107ATGCAT GCATGCTACGTA CGTACGT甚至能识别单个核苷酸的单链区！（3）降解限制酶切形成的单链突出端。1084. S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再与RNA杂交某限制酶位点（参照物）内切酶位点不能位于内含子序列中！RNA109RNA位于某限制酶位点左200bp和

31、右400bp。RNA位置不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。mRNADNA（2）用mRNA测定基因中的外显子序列110一、DNA分子的酶切 1.单酶切法； 2.双酶切法； 3.部分酶切二、DNA分子的限制性图谱 1.双酶切法； 2.部分酶切法第三节 DNA分子的片段化111 单酶切法是DNA片段化最常用的方法，用一种限制性内切酶切割DNA样品，完全酶切后，产生比识别序列数（n）多一段的DNA片段数（n+1) 。 一、DNA分子酶切1. 单酶切法123412341122. 双酶切法 用两种不同的限制性核酸内切酶切割同一种DNA分子的方法。酶切结果，DNA片段的两个末端是不同的（用同尾酶酶

32、切除外）。 113 部分酶切指选用的限制性内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。3. DNA分子的部分酶切123414114 导致部分切割的原因：（1）底物DNA的纯度低；（2）识别序列的甲基化；（3）酶用量的不足；（4）反应缓冲液不合适（离子浓度，pH）；（5）温度不适宜。115（A）为完全酶切 （B）为部分酶切116 当一种DNA分子的核苷酸序列被全部测定后，此DNA分子上所有限制性核酸内切酶识别序列也已全部知道，可以绘制出DNA分子上每种限制性核酸内切酶的识别序列分布图，这样的图称为限制性图谱，也称为物理图谱。 pPbs部分限制性核酸内切酶的限制性图谱二、DNA分子的限

33、制性图谱117质粒pPbs DNA分子酶切片段大小二、DNA分子的限制性图谱1. 双酶切法（以pPbS为例）118质粒pPbs DNA分子部分限制性图谱示意图119某质粒DNA酶切片段大小2. 部分酶切法120部分酶切法绘制质粒DNA分子限制性图谱示意图121外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第四节 DNA片段的体外连接122第四节 DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接二、齐平末端（blunt end）的连接三、PCR产物的连接四、DNA体外连接应注意的事项五、载体和外源DNA插入片段的连接结果123一、粘性末端的连接DNA连接酶

34、把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。第四节 DNA片段的体外连接1241. 两段DNA的连接依靠粘性末端1252. DNA片断与载体的连接依靠粘性末端126127ligasenick128二、齐平末端（blunt end）的连接5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1. 直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-531291972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。（1）同聚加尾法 2. 人工加尾形成 “粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的

35、情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。加尾碱基互补130缺点：优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点131用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接 linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用132 133 134缺点：可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段优点：135（3）DNA接头 (ada

36、pter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用136Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P55p-GATCCCGG- GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5接头自我连接1

37、37138接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。优点：连上后就能用。缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）防止自我连接1395p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5CIP处理-OHHO-140Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P 5GATCCCGG- H