核基因转录及加工课件

1、真核生物基因转录Roger D. Kornberg was awarded the 2006 Nobel Prize in Chemistry for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription. 真核生物基因转录特点： 1.转录启动子结构复杂，不同类型的RNA有不同的启动序列； 2.多种RNA聚合酶转录不同的RNA产物； 3.多个调节因子参与转录调节； 4.转录和翻译在时间和空间上分隔，转录后存在广泛的加工。 1. RNA聚合酶启动子、调节序列和调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用影响RN

2、A聚合酶活性。RNA Pol I: rRNA, 相对活性50-70%RNA Pol II: mRNA,相对活性20-40% miR-RNA Pol III: tRNA,相对活性10%RNA Pol IV: small ncRNA,相对活性?真核生物三种RNA聚合酶的比较真核生物的启动子及其他特异DNA序列Sequence elements within a typical eukaryotic gene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301 based on the thymidine kinase gene octamertranscription elementpro

3、moterTATA box (TATAAAA) located approximately 25-30 bp upstream of the +1 start site determines the exact start site (not in all promoters) binds the TATA binding protein (TBP) which is a subunit of TFIIDGC box (CCGCCC) binds Sp1 (Specificity factor 1)CAAT box (GGCCAATCT) binds CTF (CAAT box tf)Octa

4、mer (ATTTGCAT) binds OTF (Octamer transcription factor)+1ATTTGCATTSS核心元件区上游调控区基因调控区：由三部分组成 核心元件区：决定是否转录 由TATAbox和起始位点（TSS）组成上游调控区UPE (Upstream Promoter Element) ： 具多种调控元件 CAAT框、GC框等，含其中一种或多种，决定转录强弱（转录活化和转录起始频率），启动子的强弱取决于UPE的类型。确定真正的起始位点远端调控区： 位于转录起始位点更上游；如 珠蛋白基因的远端调控区在-1300 -3300间 增强子：使与它连锁的基因转录频率明显

5、增强的DNA序列，作为基因表达的重要调节元件。 特点： 1.增强效应明显（10 200倍）； 2.增强效应与其位置和取向无关； 3.大多为重复序列，一般50bp； 4.增强效应有严密的组织和细胞特异性，只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5. 没有基因专一性。 作用机制：通过改变模板DNA的整体结构（影响DNA-Pro复合物的结构或改变DNA超螺旋密度） eg.形成Z-DNA，增强子才有功能。 一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激附近的任一启动子。Gene cloneHACNS1增强子HACNS1（又叫CENTG2）是对进化有贡献的一个基因增强子。 如今有证据显示在

6、人类基因组发现的十一万基因增强子中HACNS1在人类与祖先黑猩猩分道扬镳之后的进化过程中变化最大，对人手指和可能改造脚踝以适应人类两腿行走意义 。 RNA聚合酶在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBPTATA DNATAF: TBP associated factorsholoenzyme（1）基本转录因子 (general transcription factor) 是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合、并启动转录的一类调节蛋白。TBP: TATA-box binding proteinTFII: pol II associ

7、ated TF(2) 转录调节因子 (transcription factor, TF) 这类调节蛋白能识别并结合转录起始点的上游序列和远端的增强子元件，通过DNA蛋白质相互作用而调节转录活性。决定不同基因的时间、空间特异性表达.转录激活因子(transcriptional activator)转录阻遏因子(transcriptional repressor)（3）共调节因子 (transcriptional regulator/ co-factor) 首先与转录因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，以调节转录活性,本身无DNA结合活性。 如果与转录激活因子有协同作用共激活因子；

8、与转录阻遏因子有协同作用共阻遏因子。常见转录因子的结构域 (domain)组成DNA结合域 （DNA binding domain)Basic AA (K/R) rich, positively charged转录激活域(trans-activation domain)TF蛋白质-蛋白质结合域（dimerization, co-factors） 谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域 (D/E-rich)脯氨酸(P)富含域最常见的DNA binding domain锌指(zinc finger)C CysH His常结合GC boxbHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)同源域(H

9、omeodomain)蛋白通过其第三个螺旋与双链DNA的大沟相结合，其N端的延伸部分则与DNA的小沟相结合，提高了稳定性 常见的转录活化结构域 真核基因表达调控真核基因转录调节是复杂的、多样的网络*不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式。*多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。*转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。真核基因表达的多级调控组蛋白修饰DNA甲基化转录调控转录后加工mRNA降解蛋白质降解蛋白质翻译翻译后修饰1.染色质水平调节主要依赖于辅助调节因子对染色质结构进行修饰。辅助调节子通过三种方式对染色质结构起调节作用：1）依

10、赖于ATP 的核小体重建复合体（ADRC）：它们依靠水解ATP 所产生的能量来改变核小体的相对位置，将DNA 序列暴露出来，使转录因子能够与之结合。这是一个物理过程，染色质本身的结构并没有变化，只改变核小体的相对位置。2）组蛋白修饰：主要通过共价修饰组蛋白的末端来改变染色质结构。当构成染色质的组蛋白发生修饰时，就会影响染色质的构型，而结构的变化引起基因转录活性的变化。3）DNA甲基化：真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化。一般而言，DNA甲基化抑制基因表达。 甲基化预测在我们的基因组中，发生甲基化的DNA影响基因的开关。基因表达能够推断与我们的身份相关联的几种属性，如性别、种族、年龄和健康，甚至

11、童年时代经历。Factors underlying variable DNA methylation in a human community cohort. Lucia L. Lama, et al. doi: 10.1073/pnas.11212491092.DNA水平的调节 真核基因一般都处于阻遏状态，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。 通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。3.RNA水平的调节转录后加工：真核基因大多为断裂基因，内含子和外显子一起被转录。转录后产物经剪接（包括可变剪切,alternative splicing）、加帽、加尾等加工修饰，才能转变

12、为成熟的mRNA 。RNA降解：包括非特异性降解（RNase, exosome)和特异性降解(NMD，RNAi)。4.蛋白水平的调节蛋白质合成:ribosome蛋白翻译，构像折叠，细胞内定位蛋白质修饰:包括磷酸化(phosphorylation),乙酰化(acetylation)，甲基化(methylation),糖基化(glycosylation),etc蛋白降解：包括非特异性降解（protease, peroxisome， vacuole)和特异性降解(Ubiquitin/proteasome system,下下次课具体讲)。真核基因表达调控的主要步骤 染色质去组装蛋白质修饰生化功能真核基

13、因转录后的加工 1.真核基因转录产物的特点： 含内含子，需经剪接去除； 需要修饰（加帽、加尾，稀有碱基）； 转录和翻译是两个相对独立的过程。 2.加工类型: 加帽、加尾 修饰甲基化、酰基化 剪接 RNA编辑RNA加工的意义： 活化使无活性的前体RNA加工成有活性的成熟RNA；（rRNA、tRNA的剪接、修饰） 改变基因的编码产物同一转录产物，不同剪接方式，编辑方式，蛋白产物不同； 调节方式加工会影响RNA的活性、半衰期、运输等，影响RNA功能的发挥； 编码蛋白质的结构基因在核浆中被转录，RNA分子很大，且很不稳定，由于大小很不一致，称为核内不均一RNA（hnRNA），其中mRNA是由hnRNA

14、加工成的。hnRNA 25%mRNA 75%在核内降解 hnRNA先加帽， hnRNA尾端被切去一段后，加poly（A）尾，切除内含子成为mRNA，进入细胞浆内。加帽 ( Cap0、CapI、CapII三种帽子结构 ) 在细胞核中进行，hnRNA的5端常为GTP，帽子化过程后，形成m7G5ppp5Np结构。 5帽子的功能： 保护mRNA免受5-核酸外切酶降解； 使mRNA进入细胞质； 对翻译起识别作用（ m7G5ppp5Np 优先与核糖体结合）。 三种帽结构初级转录物的切除与多聚腺苷酸化RNA splicing and editing剪接splicing 把断裂基因转录本中的内含子除去真核生物

15、基因是断裂基因(split gene) 外显子(exon)与内含子(intron)Alternative promoters & RNA splicing - essentially disproved the older notion that a single gene sequence encoded a single protein图8-9 可变剪接导致-淀粉酶基因在不同组织中的表达差异 内含子的剪接方式 自我剪接（由RNA分子本身完成 ）：型 型 剪接体SnRNP参与mRNA 酶蛋白参与的剪接tRNASnRNA参与的mRNA前体的剪接自我剪接与剪接体催化的剪接比较Inhibition

16、 of RNA Helicase Brr2 by the C-Terminal Tail of the Spliceosomal Protein Prp8. Science, May 23 2013; DOI: 10.1126/science.1237515mRNA的不同剪接产物 在某些生物中，在不同分化时期，RNA种类无区别，基因表达差异靠加工实现，如海胆卵母细胞。 不同剪接方式： 产物中少一个外显子； 产物中外显子不同； 内含子保留； 5剪接点改变； 3剪接点改变。剪接错误造成贫血病RNA编辑(RNA editing) DNA上不存在，在RNA产物中插入或删除几个碱基的现象。 类型： U的

17、插入和删除； G/C/A的插入（改变其阅读框）； CU互变 改变密码子，构建终止密码。 是基因表达的一种转录后调控机制RNA的编辑(RNA editing) 大多数mRNA中缺少适当的、完整的起始密码，不能正确起始翻译，经编辑后可生成成熟mRNAmRNA甲基化 m6A新发现，20%的人类mRNA 中N6-甲基A腺苷(m6A），存在5000多个不同的mRNA分子中。包括许多人类疾病基因编码的mRNA中，包括癌症以及一些大脑疾病，如孤独症、阿尔茨海默病、精神分裂症。RNA甲基化是一种可逆修饰，参与大量生物学通路和生理过程。mRNA甲基化缺陷引起疾病。肥胖症风险基因FTO突变的人m6A水平低下，食物

18、摄入和代谢异常，从而导致肥胖。据估计，全球10亿人有FTO突变，此突变是肥胖症及2型糖尿病的主要病因Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3 UTRs and near Stop Codons. Kate D. Meyer, et al. doi:10.1016/j.cell.2012.05.003荧光原位 RNA 测序（FISSEQ） Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ. Science, 27 February 2014; 环状

19、RNA影响基因表达Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature , 27 February 2013 Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature, 27 February 2013内含子的互补序列介导了外显子环化环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linear RNA，含5和3末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不

20、受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用Xiao-Ou Zhang, Hai-Bin Wang, Yang Zhang, Xuhua Lu, Ling-Ling Chen, Li Yang. Complementary Sequence-Mediat

21、ed Exon Circularization. Cell, September 18, 2014; DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.001 维生素对基因表达和生理机能的影响Interspecies Systems Biology Uncovers Metabolites Affecting C. elegans Gene Expression and Life History Traits. Cell, 13 February 2014冥想可改变基因表达？Richard Davidson ,Psychoneuroendocrinology缺乏睡眠可能改变基因表达Eff

22、ects of insufficient sleep on circadian rhythmicity and expression amplitude of the human blood transcriptome. PNAS, February 25, 2013David BaulcombeFor the discovery of RNA interference gene silencing by dsRNA and small RNAfunctional RNA transcripts ( tRNA, rRNA, miRNA)MicroRNAs (miRNAs) can regula

23、te gene expressionRNAiNature Reviews Molecular Cell Biology 8: 2336 (2007)siRNAmiRNARNA acts as a regulator of gene expression-gene silencing microRNA大多数的microRNA是通过Drosha将长链的原始转录本剪切成约含有颈环结构的65个碱基的microRNA前体，再由Dicer将其加工为含有约22个碱基的双链成熟microRNA。成熟的microRNA与Argonaute蛋白复合体结合，通过不完全配对靶向mRNA，阻遏翻译。 mse-tsRNA

24、s成熟精子中大量存在一类来源于tRNA的小分子RNA。这类小RNA的长度主要富集于29-34nt，类似但不同于睾丸中的piRNA；命名为mse-tsRNAs (mature-sperm-enriched tRNA derived small RNAs)。mse-tsRNAs的含量占小鼠精子小RNA测序reads总量的67.54%； mse-tsRNAs在成熟精子头部富集，说明其能够在受精时进入卵细胞, 可能作为一种古老的父源信息在受精时传递给卵细胞。A novel class of tRNA-derived small RNAs extremely enriched in mature mou

25、se sperm. Hongying Peng, et al., cell research, 2012/10/09RNA到RNA的复制人类细胞中的所有RNA都从DNA模版复制.从RNA到RNA的复制机制，只存在于植物和酵母菌中，与一种名为RNA依赖性RNA聚合酶（简称RdRP）有关，这种酶参与关键性细胞调控程序。研究发现，人类细胞中有数千种能直接复制的sRNA。 New class of gene-termini-associated human RNAs suggests a novel RNA copying mechanism. Philipp et al. Nature doi:10

26、.1038/nature09190RNA降解机制在 RNA 分子合成过程中发生任何的错误，或是不必要的 RNAs 累积对于细胞都是有害的。因此清除有缺陷或是不再需要的 RNAs 是细胞代谢的一个关键步骤。RNA 分子常常发生折叠。为了让外来体降解 RNA ， RNA 分子必须首先解折叠这一任务由 Ski 复合物完成。解折叠的 RNA 分子随后被引导通过连接通道到达外来体。这一 Ski 复合物将 RNA 分子提供给外来体。 Felix Halbach, Peter Reichelt, Michaela Rode, Elena Conti. The Yeast Ski Complex: Cryst

27、al Structure and RNA Channeling to the Exosome Complex. Cell, 15 August 2013; DOI: 10.1016/j.cell.2013.07.017 Contemporary concept of gene expression regulationInformation encoded in DNA is more complex than previously realized: Alternative promoters RNA splicing Non-coding repetitive DNA overlapping DNA sequences Trans-acting gene enhancers located on different