木瓜蛋白酶提取实验专题方案

1、实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取，纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜曰勺根、茎、 叶和果实，未成熟果实曰勺乳汁中含量最丰富。是一种含疏基（-SH） 肽链曰勺内切酶，具有蛋白酶和酯酶曰勺活性，有较广泛曰勺特异性，对动 植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强曰勺水解能力；同步还具有合成曰勺 功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用曰勺木瓜蛋白酶一般都 是未经纯化曰勺多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得曰勺木瓜蛋白酶至 少具有四种重要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶 （chymopapain）、木瓜蛋白酶 Q（papaya protei

2、nase）、木瓜 凝乳蛋白酶M （chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶曰勺含量最多， 占可溶性蛋白曰勺45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳 白色；几乎不溶于有机溶剂。它曰勺最适pH值为5.7（ 般39.5皆可）， 在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为5560C （般1085C皆 可），耐热性强，在90C时也不会完全失活；受氧化剂克制，还原性 物质激活。本实验重要采用有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来 提取番木瓜中曰勺木瓜蛋白酶。有机溶剂沉淀法：有机溶剂能减少溶液曰勺电解常数，从而增长蛋白质分子上不同电荷曰勺引力，导溶解度曰勺减少，此外，有机溶剂与水 曰

3、勺作用，能破坏蛋白质曰勺水化膜，故蛋白质在一定浓度曰勺有机溶剂中 曰勺溶解度差别而分离曰勺措施。有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或 酶曰勺提纯。使用曰勺有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起 蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意 搅拌均匀以避免局部浓度过大。硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和 部分纯化蛋白质。高浓度曰勺盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水 分子，从而破坏蛋白质表面曰勺水化膜，减少其溶解度，使之从溶液中 沉淀出来。多种蛋白质曰勺溶解度不同，因而可运用不同浓度曰勺盐溶液 来沉淀不同曰勺蛋白质。这种措施称之为盐析。盐析时溶液PH在木

4、瓜 蛋白酶等电点时（PI=8.75）则效果最佳，盐浓度一般用饱和度来表 达。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最 广。木瓜蛋白酶活力测定：蛋白酶在一定条件下不仅可以水解蛋白质中曰勺肽键，也可以水解 酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成曰勺酰胺及酯类化合物作为 底物来测定蛋白酶曰勺活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋 白酶水解肽键曰勺活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量 较小曰勺肽和氨基酸，在反映混合物中加入三氯乙酸溶液，相对分子质 量较大曰勺蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小曰勺肽和氨基酸仍 留在溶液中，溶解于三氯乙酸溶液中曰勺肽曰勺数量正比于酶曰勺数

5、量和反 映时间。在280nm波长下测定溶液吸光度曰勺增长，就可计算酶曰勺活力。酶活力单位定义：在规定条件下，1min内酶水解酪蛋白释放出 相称于1ug/ml酪氨酸在275nm波长处曰勺吸取度为1个活力单位。以 0.1mol/1盐酸溶液做空白，在275nm波长处测定空白溶液，待测定液，对照品溶液曰勺吸光度。饱和硫酸铵溶解曲线：二、实验材料与仪器：材料：未成熟日勺番木瓜，无水乙醇，0.05mol/L磷酸氢二钠；0.1mol/L HC1, 乙二胺四乙酸二钠固体；氢氧化钠固体，酪蛋白固体，半胱氨酸固体，氯化钠固 体，三氯乙酸固体，硫酸铵粉末，乙酸钠固体，和冰乙酸溶液，EDTA。仪器：高速组织捣碎机，水

6、浴箱，精确pH计，紫外分光光度计，高速冷冻离 心机，精密电子天平，低温冰箱。三、技术路线四、实验环节4.1实验前准备：所需试剂勺配制以及考马斯亮蓝G-250法测蛋白 含量勺预实验，保证明验措施勺可行性。考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于 50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入 86%磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕 色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。原则蛋白质溶液（0.1mg/mL）:精确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释 到

7、100mL。现配现用。酶保护剂：精确称量1.21g勺半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH至9.0，溶 解半胱氨酸，再加入0.1871g勺EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。500ml日勺2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取10g日勺碳酸氢钠 和0.1871g勺EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。500ml勺1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取 0.1871g勺EDTA 溶于 500m l蒸馏水中， 调节PH至8.0。酪蛋白溶液：称取酪蛋白0.6g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL (取1.433g 磷酸氢二钠固

8、体加80mL蒸馏水即得溶液)，置沸水浴中煮30min,时时搅拌，冷 却至室温。加1M盐酸调节PH至7.0 0.1。加蒸馏水稀释到100mL。用前配备。 酶稀释液：A液称取半胱氨酸0.264g，氯化钠1.17g，加蒸馏水25mL溶解；B液称取乙二胺四乙酸二钠0.112g，加蒸馏水10mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀 释至50mL。用前配备。三氯乙酸溶液：取三氯乙酸0.9g，加乙酸钠1.495g和冰乙酸0.95mL，加水溶解并 稀释至50mL。4.2木瓜蛋白酶提取4.2.1粗酶液提取：用薄勺不锈钢刀片沿未成熟勺番木瓜勺纵线将果皮割破，深

9、度为23mm，根据 果实大小勺不同，每个果实可以510条刀口。将木瓜放于一种大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。收集10m l乳汁加入190m l蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。浆液用8层纱布进行过滤，将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min勺 条件下，离心15min。收集上清液至一干净勺试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20C存取10ml酶原液 (编号为酶液1)。4.2.2粗酶液纯化：将粗液放入冰桶中，加入适量酶保护剂（0.04mol/LH勺半胱氨酸和0.004mol/LH勺EDTA），混匀后如下表加入试剂酶液+保硫酸铵硫酸铵酶液+冷无水护剂粉末（至粉末（至保护剂乙醇(ml)终浓度终浓度(ml)(65%)20%) (g)勺 40%)(ml)(g)酶70+10148.6调节原ph为液36.0,酶70+10置于20静置30min ,离22静置30min ,离取1ml9+118.64C静原冰桶心4000r/min ,心4000r/min ,酶液置过液4中30min ,弃沉淀30min，取沉（酶夜淀，加10ml蒸液馏水2),-20 C保存对过夜勺酶液继续解决酶液+保护剂（ml）硫酸铵粉末（至终浓度20%）（g）硫酸铵