液相串联质谱法在生物样品分析中的几个关键问题市公开课获奖课件

1、10月10日LC/MS/MS在生物样品分析时关键问题吉林大学药物代谢研究中心 顾景凯吉林大学药物代谢研究中心第1页第1页10月10日 简介 LC/ESI-MS/MS是最近发展成熟分析技术，它集高效液相色谱高分离性能与质谱高灵敏度、高选择性优点于一体，已成为定量测定生物样品中药品及其代谢产物最强有力分析手段。 然而，它在分析生物样品过程中也碰到了含有挑战性问题基质效应，对于以人参皂苷为代表中性、热不稳定、难于离子化皂苷类化合物来说，基质效应影响更为严重。 离子克制效应不但影响检测灵敏度，也影响定量准确性，因为这种克制效应在不同个体相同生物基质间、甚至同一个生物样品在不同色谱保留时间可能均不同，这

2、么就会使测试结果准确性受到严重影响。 吉林大学药物代谢研究中心第2页第2页10月10日基线 1234567891011Time, min20%40%60%80%100%Intensity, cps吉林大学药物代谢研究中心第3页第3页10月10日血浆样品经液液萃取处理得到谱图 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大学药物代谢研究中心第4页第4页10月10日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%血浆样品经SPE处理得到谱图 吉林大

3、学药物代谢研究中心第5页第5页10月10日尿样经液液萃取处理得到谱图 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大学药物代谢研究中心第6页第6页10月10日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%尿样经2次水洗后液液萃取处理得到谱图 吉林大学药物代谢研究中心第7页第7页10月10日吉林大学药物代谢研究中心考察基质效应办法柱后补偿技术（Post-column addition/infusion, PCA/PCI）补偿原则品溶液，以空白基

4、质提取物进样测定-位置、强度原则溶液进样；等量原则溶液加入空白基质提取物中进样；两者峰面积比较 液相系统 色谱柱 质谱 三通阀 注射泵 第8页第8页10月10日基质效应产生原因外源杂质引入（不同厂家生产试管、肝素锂）生物样品内源性基质共洗脱作用co-elution生物样品与分析物形成新化合物柱超载作用(column overload)吉林大学药物代谢研究中心第9页第9页10月10日吉林大学药物代谢研究中心影响检测灵敏度1影响定量准确性2基质效应结果第10页第10页10月10日Key Point 2选择适当内标提升待测物离子化效率、减少基质效应Key Point 1关键问题提升LC/MS/MS工

5、作效率Key Point 3吉林大学药物代谢研究中心第11页第11页10月10日提升离子化效率 1、改进雾化效果 产生更多更小液滴，提升离子/分子转化比。 2 、模式选择及优化办法 酸性化合物流动相中加盐,如甲酸铵、乙酸铵，或碱（氨水）来增强化合物离子化，普通采用负离子检测模式。 碱性化合物流动相中加酸以增强化合物离子化,加甲酸效果也许要好于醋酸和三氟乙酸。酸根负离子会与样品正离子结合减少离子化效率，且三氟乙酸会明显克制质谱信号响应，普通用正离子方式检测。 3、谨慎选择添加剂 商品化LC-MS级醋酸铵、甲酸铵含有表面活性剂，克制电离。试验中若需要，能够用氨水加酸调整而成。 吉林大学药物代谢研究

6、中心第12页第12页10月10日 4、优化仪器参数（DP、CE、IS等） 5、盐类对离子信号影响 普通小分子盐摩尔浓度比较高时，在电喷雾系统中有强烈竞争性离子化作用，造成较强离子克制效应，使得待测物灵敏度明显减少。 另一方面，盐类存在将产生一系列离子加合峰，使得谱图解析变复杂。另外，太多盐类会腐蚀和污染质谱系统硬件，严重时造成硬件损坏，需要及时清洗。 高浓度盐对电喷雾有明显负作用，微量盐也许有助于一些物质灵敏度提升。一些不挥发盐，如磷酸盐、氯化钠等，对质谱造成不可逆损伤。高盐类样品，进样前普通要进行脱盐处理。6、控制进样浓度及上样量 色谱柱、质谱超载 吉林大学药物代谢研究中心进样浓度大上样量大

7、第13页第13页10月10日吉林大学药物代谢研究中心Mass Spectrometry Reviews, , 20, 362 387第14页第14页10月10日消除/减小基质路径吉林大学药物代谢研究中心样品处理液相条件选择质谱条件选择第15页第15页10月10日Protein-precipitationLiquid-liquid partitioning(extraction) Solid Phase extractionOff-line/On-line 2-Dimension LC(column back-flushing)吉林大学药物代谢研究中心样品前处理办法 选择适当样品前处理方法是消除

8、基质效应影响最有效方式，对于不同样品处理方法，基质对每种组分影响也不同，要经过试验综合其它参数（提取回收率，提取稳定性，定量限等）来确定样品前处理方法。第16页第16页10月10日柱子选择 填料性质、大小、柱长、柱子口径流动相选择 构成、百分比、流速、缓冲盐、信号增强剂、pH值；洗脱方式选择（等梯度、梯度）；柱后补偿 碱性药物丙酸、异丙醇；酸性药物2-（2-methoxyethoxy)ethanol。吉林大学药物代谢研究中心优化液相色谱条件 适当地增长待测组分保留时间；减少进样体积第17页第17页10月10日离子源（ESI、APCI）选择：总趋势 ESI较APCI更易受基质效应影响。检测方式（负离子、正离子扫描方式）吉林大学药物代谢研究中心优化质谱检测条件第18页第18页10月10日吉林大学药物代谢研究中心双内标法提升LC/MS/MS分析准确性第19页第19页10月1