生物分离工程技术固液分离技术离心技术市公开课获奖课件

1、生物分离（工程）技术主讲：吴元喜E-mail: 联系电话：027-877923048月 第1页第1页 普通生物工业过程 第2页第2页提取精制优化目的和工艺设计总目标： 高产率、品质优、低成本、操作简便、无环境污染。 惯用单元操作出现频率： 离子互换 75；亲和过程 60；沉淀分离 57； 凝胶过滤层析50；其它方法 33。单元操作选择要求： 工艺前期：不要求分辨能力高，但要求负荷能力大 工艺后期：分辨能力和回收能力尽也许高，第3页第3页生物工业下游技术普通工艺过程第4页第4页第三章 固-液分离技术第一讲 过滤技术第二讲 离心技术第5页第5页第二讲 离心分离技术一、概述二、离心分离原理 三、离心

2、操作注意事项四、思考题 第6页第6页一、概述1、序言2、离心形式和目的 3、离心机分类第7页第7页1、序言 1924年 Svedberg（瑞典）设计并制造出可产生相称于5000倍地球引力离心机。1926年取得诺贝尔化学奖 离心技术主要用于各种生物样品分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大离心力作用，使悬浮微小颗粒（细胞器、生物大分子沉淀等）以一定速度沉降，从而与溶液得以分离。沉降速度取决于颗粒质量、大小和密度。第8页第8页颗粒沉降 当一固体微粒经过无限连续介质时，它运动速度受到两种力影响：一是该微粒受到因微粒与流体介质间密度不同而产生浮力作用，二是微粒所受到流体阻力作用。当浮力与阻力

3、达到平衡时，该微粒即以恒定速度沉降。第9页第9页颗粒沉降（续） 在稀溶液中，作用于单个球形微粒上阻力FD，可用Stocks(斯托克斯)定律表示：假设该微救为球形,其沉降过程如图所表示，则该微粒所受浮力（FB）可由下式表示d-沉降颗粒直径，cm； s ，-微粒及液体介质密度，gcm3 ；-微粒加速度m/s2；-物质沉降速率，cms；-介质黏度，g(cms)。 颗粒较小时，第10页第10页颗粒沉降（续） 当Re1时，阻力表示为： 当球形粒子在介质中开始运动时速度较小，作用其上阻力亦较小。当阻力与浮力平衡时，微粒加速度为零。微粒运动速度方程为：重力沉降时，微粒加速度即重力加速度，即g为重力加速度常数

4、，m/s2离心沉酵时，微粒运动速度方程为：转鼓回转角速度，rs转鼓中心轴线与微粒间距离，m第11页第11页2、离心形式和目的离心形式 离心过滤：在有孔转鼓离心机小经过过滤介质分离悬浮液； 离心沉降：利用固液两相比重差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降分离 (如用于净制含少许固体液体时也称离心澄清)； 离心分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布差异，分离不同比重液体。离心目标 固-液分离、液-液分离第12页第12页3、离心机分类(1)转速和温度：低、高、超速；冷冻和常温；(2)用途：工业或试验用，分析或制备；(3) 形式和操作：过滤、沉降或分离；连续、半连续、间歇；(4) 结构特点：转鼓、

5、长管式转筒、角式和外摆式转子、分析型转子和区带转子等。依驱动方式有手摇式、油涡轮式、气动式、磁悬式和电动式等。依旋转轴位置有直立式、水平式、倾斜式等第13页第13页二、离心分离原理 1、离心分离先决条件2、离心机选择3、离心办法选择4、离心力和相对离心力5、物质沉降系数 6、离心条件确实定第14页第14页1、离心分离先决条件不同密度或不同大小及形状物质在重力作用下沉降速率不同，在形成密度梯度液相体系中平衡位置不同。离心分离过程就是以离心力加速不同物质沉降分离过程。被分离物质之间必须存在或经人为处理产生密度或沉降速率差异才干以离心方法进行分离。第15页第15页2、离心机选择常速离心机：最大转速在

6、8000rmin以内，相对离心力(RCF)在ll04g下列。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物分离，也用于酶结晶等较大颗粒分离。高速离心机：最大转速为(12.5)104rmin，相对离心力达到(104105)g，主要用于各种沉淀物、细胞碎片和细胞器等分离。超速离心机:最大转速达(2512)104 rmin，相对离心力能够高达106g。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等分离纯化，样品纯度检测，沉降系数和相对分子质量测定等。第16页第16页三种不同级别制备离心机 类 型普通离心机高速离心机超速离心机最大转速6，00025，00075，000以上最大相对离心

7、（g）6，00089，000510，000以上容 量 ml-Lml-1.5Lml-1.5L分离形式固液沉降分离固液沉降分离密度梯度区带分离或差速沉降分离。离心管平衡允许误差0。25克0。1克01克第17页第17页3、离心办法选择I.沉淀离心II.差速离心：III.密度梯度离心： 速率区带离心与等密度区带离心第18页第18页I.沉淀离心 沉淀离心技术是当前应用最广一个离心办法。普通是指介质密度约lgml，选取一个离心速度，使悬浮溶液中悬浮颗粒在离心作用下完全沉淀下来，这种离心方式称之为沉降离心。 依据颗粒大小来拟定沉降所需要离心力。主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料，密度在1.181

8、.31gml左右离心分离。沉降速度与离心力和颗粒大小相关。 第19页第19页II.差速离心差速离心:是指采取不同离心速度和离心时间，使不同沉降速度颗粒分批分离方法。微小颗粒与液体分子间相互影响力被离心力克服，原条件下稳定悬浮各种微小粒子又依本身相对密度大小等条件次序沉淀出来。普通用于分离沉降系数相差较大颗粒。第20页第20页差速离心-物质沉降过程长处是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差。可用于组织匀浆液中分离细胞器和病毒分级沉淀第21页第21页第22页第22页沉淀离心和差速离心过程第23页第23页III.密度

9、梯度离心法密度梯度离心法（区带离心法）： 是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分派到梯度中一些特定位置上，形成不同区带分离方法。（1）差速区带离心法：在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度介质不同区域上形成区带方法称为差速区带离心法。（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，经过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度等密度区带离心产生梯度二种方式。第24页第24页密度梯度离心法特点长处： 分离效果好，可一次取得较纯颗粒； 适应范围广，能象差速离心法同样分离含有沉降系数

10、差颗粒，又能分离有一定浮力密度差颗粒； 颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并预防已形成区带由于对流而引起混合。缺点： 离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。第25页第25页(1)差速区带离心法特点离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质液面上，离心时，因为离心力作用，颗粒按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降颗粒逐步分开，最终形成一系列界面清楚不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快。离心必须在沉降最快大颗粒抵达管底前结束，样品颗粒密度要大于梯度介质密度。梯度介质通惯用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60。第26页第26页(2)等密度离

11、心法特点离心时，样品不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们密度相等等密度点特定梯度位置上，这就是等密度离心法。处于等密度点上样品颗粒区带形状和位置均不再受离心时间所影响。提升转速能够缩短抵达平衡时间，离心所需时间以最小颗粒抵达等密度点（即平衡点）时间为基准，有时长达数日。梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7 g/cm3。 第27页第27页4、离心力“ F ”和相对离心力“ RCF ”离心力“ F ”相对离心力“ RCF ”离心机转速与离心力列线计算图第28页第28页离心力“ F ” 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：a -粒子旋转

12、加速度，m -沉降粒子有效质量，-粒子旋转角速度，r-粒子旋转半径( cm )。第29页第29页相对离心力“ RCF ” 相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒离心力相称于地球重力倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相对离心力可用下式计算：RCF = 1.119105(rpm)2 r( rpm revolutions per minute每分钟转数，r/min )第30页第30页离心机转速与离心力列线计算图普通情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。在汇报超离心条件时，通常总是用地心引力倍数“g”代替每分钟转数“rpm”.转速与离心力换

13、算:先在r标尺上取已知半径和在rpm标尺上取已知离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上交叉点即为相应相对离心力数值。第31页第31页5、物质沉降系数假定液体浓度稀薄其黏度为O，颗粒物质为正圆形，则混溶于液体颗粒性物质在引力场作用下沉降过程仅受重力和液体浮力双重影响。离心时作用于沉降颗粒离心力是：依据Stokes定律，离心时沉降颗粒碰到阻力是：d-沉降颗粒直径，cm； -沉降颗粒密度，gcm3；-溶剂液体密度，gcm; -溶剂液体黏度，g(cms)。第32页第32页物质沉降系数(续)在离心力作用下，假如沉降物质沉降速度是不变，离心力就等于阻力，f1f2 -物质沉降速率，cms；

14、d-沉降颗粒直径，cm； -沉降颗粒密度，gcm3；-溶剂液体密度，gcm -溶剂液体黏度，g(cms)。 S 称为斯维德伯格(Svedberg)单位 第33页第33页物质沉降系数(续)物质颗粒沉降S大小与物质颗粒直径平方成正比，与沉降颗粒和溶剂液体密度之差成正比，与溶剂液体黏度18倍成反比。因为液体黏度受液体性质和温度影响很大因此S通常定义为20时以水作溶剂物质沉降值。在离心力作用下，因为悬浮颗粒所处液体环境不同，(-) 0时S为正数，颗粒向离心方向沉淀，(-)0 时S为0，颗粒物质与液体密度相等，受力均衡，颗粒维持原位不动，(-)O时S为负数，液体中物质颗粒朝向心方向浮动。S与物质颗粒大小

15、和密度及溶剂黏度间关系可表示为：第34页第34页6、离心条件拟定 离心力离心时间及计算温度和pH值第35页第35页离心力 离心力大小与转速平方(rpm2)及旋转半径(r)成正比。在转速一定条件下，颗粒距离心轴越远，其所受离心力越大。在离心过程中，伴随颗粒在离心管中移动，其所受到离心力也在改变。普通离心力数据是指其平均值，即是指在离心溶液中点处颗粒所受离心力。 RCF = 1.119105(rpm)2 r第36页第36页离心时间及其计算离心时间沉降时间计算转子效率因子(K)第37页第37页离心时间对于常速离心、高速离心和差速离心来说，离心时间是指颗粒从离心管中样品液液面完全沉降到离心管底时间，称

16、为沉降时间或澄清时间；对于密度梯度离心而言，离心时间是指形成界线分明区带时间，称为区带形成时间；而等密度梯度离心所需离心时间是指颗粒完全达到等密度点平衡时间，称为平衡时间。沉降时间是指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需时间。沉降时间决定于颗粒沉降速度和沉降距离。第38页第38页沉降时间计算t沉降时间(s)； S颗粒沉降系数(s)；转子角速度(rads)； 1，2 分别为旋转轴中心到样品液面和离心管底距离(cm)。 第39页第39页转子效率因子(K)转子效率因子K与转子半径和转速相关。生产厂家已经在转子出厂时标示出了最大转速时K值。依据公式 计算出其它转速时K值。在选定了所使用离心机和转子以后

17、，r1，r2已拟定，对于某一详细颗粒来说，沉降系数S为定值，2 t为一常数,因此离心时对颗粒沉降起决定作用是转子转速和沉降时间t。因此K值越小，其沉降时间就越短，转子使用效率就越高。第40页第40页2 t为一常数 离心时对颗粒沉降起决定作用是转子转速和沉降时间t时,操作时能够采用较高转速离心较短时间，或采用较低转速离心较长时间，只要2t不变，就能够得到相同离心效果。比如:比如采用10 000rmin离心10min， 2t=（2rpm/60）2t=6.5785108(s-1) 假如改用5000rmin离心40min， 2t=6.576608(s-1) 两者基本相同，离心效果相近。第41页第41页

18、温度和pH值离心温度普通控制在4右，对于一些耐热性较好生化物质，也能够在室温条件下进行离心分离。但是在超速离心和高速离心时，由于转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻系统，使温度维持在一定范围内。温度控制是由离心机本身设置温度调整系统进行，在离心前转子和待离心分离液体都必须置于冷室或者冰箱中预冷。离心介质pH值必须是处于待分离物质稳定pH值范围内，必要时能够采用缓冲溶液。过高或过低pH值也许引起酶等生物活性物质变性失活，还也许引起转子和离心机其它部件腐蚀，应当加以注意。第42页第42页三、离心操作注意事项 1. 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，离心管必须对

19、称地放在转头中。2. 装载溶液时，要选取适合离心管，无盖离心管内液体不得装过2/3.3.每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，严禁使用明显变形、损伤或老化离心管。第43页第43页离心操作注意事项(续)4. 离心过程中不得随意离开，应随时观测离心机上仪表是否正常工作，如有异常声音应马上停机检查，及时排除故障。5. 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅阐明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，统计累积使用时间，若超出了该转头最高使用限时，则须按要求降速使用。第44页第44页四、工业离心机碟片式

20、离心机结构第45页第45页牛乳特点与分离 牛乳中含有脂肪、脱脂乳以及各种固体杂质，三者之间脂肪相对密度最小，脱脂乳次之，固体杂质相对密度最大。将其静止数小时后，将分成三层。如图所表示。第46页第46页碟片式离心机与牛乳分离 在转鼓中加入一组圆锥形碟片，由于颗粒所走距离减小，因此相应分离能力就增长。 借离心力作用使混合液达到转鼓中心，重颗粒（杂质）向下移动，最后沉降在转鼓四周，重液体（脱脂乳）向下通过圆盘空间中心，经最高圆盘上面通道从圆盘排出。第47页第47页第48页第48页第49页第49页（2）分离钵主要结构为整个分离钵支持部分，中心管是牛乳进入通道，放在底座上面一、槽沟内，当分离钵旋紧时，可使顶罩与底座之间封闭。用于支承杯盘，其内部有三个沟槽与底座三个孔眼配合中，形成牛乳通道由此进入分离杯盘中在盘内外表面焊有突起物，并有三个孔与中杯盘配合形成牛乳上行通道眼焊接突起物，使杯盘间形成一定距离，不同类形分离机，杯盘数目不同，越多离效果越好，能力越大