酶组织化学概论市公开课获奖课件

1、酶组织化学Enzyme Histochemistry1第1页第1页 概 述1、酶（enzyme)：由活细胞产生，能在体内起催化作用一类特异性蛋白质生物催化剂。物质EABDC酶 促 反 应E底物substrate2第2页第2页 概 述2、酶命名：习惯命名法命名原则举例1、酶对底物特异性脂肪酶，核酸酶2、依据催化反应性质（含有特异性）催化底物水解反应，称水解酶3、依据底物与催化反应性质催化乙醇脱氢酶，称乙醇脱氢酶。4、依据酶起源胃蛋白酶，胰蛋白酶等5、依据酶特性碱性磷酸酶，酸性磷酸酶3第3页第3页 概 述3、酶分类：按酶促反应性质，国际生物化学 酶学会（EC）将酶分为六类，下列表：EC编号 酶名

2、1 氧化还原酶（oxidoreductases) 2 转移酶（transferases) 3 水解酶（hydrolases) 4 裂解酶（lyases) 5 异构酶（isomerases) 6 连接酶或合成酶 （ligases or synthetases)4第4页第4页一、组织化学显示酶办法（一）免疫组织化学（immunohistochemistry)Ag+Ab Ag-Ab胰岛B细胞5第5页第5页一、组织化学显示酶办法(二）酶组织化学（enzyme histochemistry) 1、定义：酶组化是用组织化学办法证实酶存在一门学科，其目的在于阐明组织细胞内化学反应、功效及其生物学意义。维持C

3、形态和执行功效化学物质有色形象探讨其在生理或病理状态下形态与机能相结合一门学科6第6页第6页2、研究化学物质办法：（1）将组织、细胞完全破坏和捣碎，进行检查。 生物化学办法。（2）提取组织细胞内特殊构成成份或细胞器、膜系统以探讨其中存在化学物质及其功效。 组织化学办法。（3）不破坏组织细胞，保持其完整结构，使其中化学物质在原位变成可见物质，理解其存在和功效。 细胞化学办法（酶组化）7第7页第7页二、酶组织化学基本理论（一）酶定位 localization of enzyme 在一定组织细胞及细胞器超微结构中存在着特定酶，其存在特定部位称为酶定位。 细胞内酶定位因酶种类及细胞器不同而有差异，它们

4、都有自己固定位置。因此所采取定位检验法必须准确。 酶 亚细胞部分DNA核苷酸转移酶 核 SDH、CCO 线粒体 G-6-P 内质网 ACP 溶酶体 5-核苷酸 质膜 LDH 胞液8第8页第8页线粒体结构酶类间质三羧酸循环中酶等内膜SDH，CCO等内外膜间空隙腺苷酸激酶、核苷酸磷酸激酶等外膜NADH脱氢酶、细胞色素b5还原酶等9第9页第9页二、酶组织化学基本理论（二）酶反应 是在一定条件下，组织细胞内酶作用于底物，将底物分解产物作为反应产物，在作用部位进行捕获，使其含有可见性。这种酶促反应称为组织化学酶反应（enzyme reaction of histochemistry)ESIRPE捕获反应

5、FRP10第10页第10页ESIRPE捕获反应FRP S：底物，酶含有只作用于该底物性质称底物特异性IRP（initial reaction product)：初级反应产物，指底物被酶直接分解物质，不溶于水、脂类最为抱负，以免发生扩散。FRP(final reaction product)：最后反应产物，指不溶性IRP被偶联而显色。11第11页第11页三、光镜酶组织化学证实法（一）金属-金属盐法（metal precipitation method)1、定义：指金、银、铜、铁、铝、钴等金属，其盐和化合物或其本身都含有颜色，容易发生呈色反应。并且酶反应产物和金属多半能够结合。因此，捕获酶反应分解

6、产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再现出酶反应部位，以证实酶存在。这类办法总称为金属-金属盐法或金属沉着法。大部分水解酶用此办法证实。Fe2+DP+DPFe2+12第12页第12页2、办法：三种（1）第一个办法：Gomori和高松（1939）SE+MP1P2+Fe置换显色沉着在作用局部证实酶反应酶反应13第13页第13页如：证实碱性磷酸酶办法R-PO4Na2+H2O R-OH+CaHPO4 CoHPO4 金属置换ALPCa2+Co2+CoS(NH4)2S酶反应沉着显色用钴置换硫化钴法（CoS method)用银置换硝酸银法或银反应法（silver method)14第14页第14页（2）第

7、二种办法：是酶作用于酶底物后生成分解产物与底物孵育液中金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，然后使其显色。反应式下列：R-PO4Na2+H2O R-OH+PbHPO4 PbSPb2+(NH4)2S酶反应沉着显色使用此种办法条件是底物溶液中H+浓度为中性或弱酸性，经常利用易取得硝酸铅或醋酸铅。因此本法常被用于ACP和在中性附近起作用磷酸酯酶类。本法称为硫化铅法（PbS method)15第15页第15页（3）第三种方法：与使用天然底物前两种方法不同，本法使用是人工合成底物，在酶作用下，底物分解产物与特定金属结合，马上显色，或经过显色操作使其显色，然后进行观测。16第16页第16页3、金属-金属盐

8、法优缺点（1）长处： 底物、捕获剂价格廉价。 金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调鲜明，反差比较明显。（2）缺点： 易退色。 组织细胞中有些成份可吸附金属离子，产生假阳性反应。铅法显示ACP17第17页第17页三、光镜酶组织化学证实法（二）偶联偶氮色素法（coupling azo dye method) 或称偶氮色素法1、定义：是用人工合成酶底物，在酶作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素，以此证实酶定位。SEP+N偶联偶氮反应偶氮色素18第18页第18页偶氮色素颜色由重氮盐种类所决定。如：坚牢蓝B蓝色 坚牢红TR红色 坚牢蓝VB褐色2、底物萘酚系列化

9、合物2-萘酚、1-萘酚、6-溴-2-萘酚、萘酚AS、萘酚AS衍生物等 溶解性逐步减少肾小管中碱性磷酸酶19第19页第19页3、偶联偶氮色素法优、缺点（1）优点：正常组织细胞中无此底物。 作用时间短，不易发生酶丢失。不易褪色。（2）缺点：底物价格昂贵。底物分解产物有不同程度扩散。重氮盐有不同程度克制酶活性作用。故必须选取克制作用最弱种类使用。 肝细胞中ACP20第20页第20页4、办法： （1）同时偶联法：这种偶联法，是在底物混合液中，通过酶分解作用所得到沉着物，马上形成重氮化合物和偶氮色素。 （2）后偶联法：该办法是为了预防重氮盐对酶克制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍

10、于重氮盐液中，使其形成偶氮色素。 以上两种偶氮色素形成原理完全相同。 由于偶氮色素法开展，一些用金属-金属盐法不能证实酶，现在能够证实了。此法已被广泛使用。 21第21页第21页三、光镜酶组织化学证实法（三）色素形成法（pigment formation method) 这是一组显示酶定位证实法，它与偶氮色素法不同，在酶作用下，使无色化学物质在局部形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法。办法所显示酶1、四唑盐法脱氢酶2、靛酚蓝法氧化酶3、靛兰形成法（靛蓝法）磷酸酶、酯酶4、联苯胺色素法过氧化物酶5、黑色素形成法DOPA-氧化酶、酪氨酸酶6、白色色素法过氧化氢酶22第22页第22页1、四唑盐法

11、tetrazolium method（1）定义：在含有四唑盐或双四唑盐底物混合液中，在脱氢酶作用下，从底物分离出来氢原子与无色四唑盐或双四唑盐结合形成红色或蓝色甲簪（formazan）或二甲簪（difomazan）色素。这种色素沉着于酶作用所在部位因而得知酶定位。该法主要证实各种脱氢酶 。23第23页第23页（2）四唑盐种类 三苯四唑氯化物（TTC） 蓝四唑盐（BT） 新四唑盐（NT） 硝基蓝四唑盐（Nitro-BT) 四氯四唑蓝氯化物（TNBT）是脂溶性，能共染组织细胞中脂肪。24第24页第24页肾小管中SDH心肌中LDH25第25页第25页2、靛酚蓝法 indophenol blue me

12、thod Nadi反应,是用于检测氧化酶办法。把二甲基-对-苯二胺和-萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放氧与此两者结合，形成靛酚蓝，而显示出酶定位。 有些人使用新Nadi法，既以4-氨基-N、N-二甲基萘胺（AND）代替二甲基-对-苯二胺。本法也适合用于证实细胞色素氧化酶和过氧化物酶。26第26页第26页肾小管中细胞色素氧化酶27第27页第27页本法主要是以酯型吲哚酚化合物为酶底物，在酶作用下，分解出吲哚酚；在氧存在情况下形成蓝色靛蓝，于酶所在部位显色。此法又称吲哚酚法（indoxyl method）。 酯型吲哚酚化合物: 磷酸吲哚酚 醋酸吲哚酚 丁酰吲哚酚 验证磷酸酶、酯酶等。3、靛兰形成

13、法（靛蓝法）indigo formation method:28第28页第28页肾间质细胞中酯酶29第29页第29页四、酶组织化学基本条件用组织化学办法在组织细胞内证实酶，主要是要具备三个条件：第一：保留细胞结构（preservation of structure)。第二：保留酶（preservation of enzyme)。第三：保留定位（preservation of localization)。30第30页第30页（一）生物化学方面要求 酶组织化学基础是组织化学，而化学反应又是组织化学基础。因此化学反应各种条件和影响化学反应各种原因都要考虑到。 酶是一个催化剂，但其并不参加化学反应本身

14、，只是起到加强酶组织化学反应，显示出酶活性高低作用。影响酶活性原因有各种，如底物浓度、反应产物强弱、温度、pH值和试剂质量等。同一个酶，在不同条件下，所显示酶活性能够相差悬殊。因此，在进行酶组织化学研究时，应极其重视化学反应良好程度，严格控制试验条件，这么才干对取得结果作出科学判断和分析。31第31页第31页（二）形态学方面要求1、尽也许保持组织细胞生活时形态和结构。2、尽也许保持组织细胞生活时化学成份和酶活性。3、染色法是已知化学反应，各种条件均可控制。4、反应产物是一个有色沉着物，颗粒要细，并能保留在原位。其颜色深度与物质含量或酶活性含有一定量效关系。5、显示可视物质必须含有稳定性，以利于

15、重复观测。6、反应产物要含有特异性。肿瘤细胞SDH：四唑盐法32第32页第32页（三）酶组织化学不足1、定位方面不足：酶组织化学要求是使某一物质在原位上显示出来。但由于吸附、弥散和溶解等现象，其定位改变或假定位是多见，给分析结果带来很大困难。在进行酶组化染色反应时，用恒冷箱切片法、控制孵育条件、温度、pH值和时间可预防反应产物扩散。酶组化大体定位核仁、胞质、C器等电镜细胞化学微细定位C器微细结构分子水平定位33第33页第33页影响酶定位原因必要条件要求底物1、必须容易被水解2、底物应尽量纯反应产物1、既不溶于水也不溶于脂中2、必须易染，既有较高着色指数或转化为易着色产物。偶联剂对反应产物必须含

16、有高度偶联率。34第34页第34页2、定性方面不足：由于组化是利用已知化学反应来显示细胞内化学成份性质，因此它含有特异定性优越性。但同样有不足。（1）非特异性问题：有些办法原理是依据一些特殊基团或一些特性，不可避免地造成一些非特异性染色。（2）定位不准确：如PAS法显示糖原。（3）有些物质被掩盖，不能所有显示出来。如隐式脂肪。为了确切定位，组化染色反应中，必须有对照试验。能够极大提升定性可靠性。35第35页第35页3、定量方面不足：（1）原因：定量不准确是酶组化最大不足，它不同于试管中化学分析，而是在极复杂细胞微环境内进行化学反应，所要研究物质或酶活性，均受到细胞内其它物质和细胞外各种原因影响

17、。有些原因性质不明，难以控制。组化反应产物都展现可视有色沉着物，存在于细胞内不均匀复杂结构中，不可能像化学反应在试管中得到均质产物，也不可能进行精密光谱吸取分析。36第36页第36页惯用组化定量办法使用加号与积分法表示。以中性粒细胞中碱性磷酸酶活性评级阐明。（2）定量办法：符号等级着色强度-阴性+弱阳性浅灰/棕色沉着物，弥散、无致密颗粒+较强阳性均着色/棕黑色致密片状物，占胞质1/2+强阳性充斥棕黑色颗粒，致密块状沉着物较少+极强阳性深黑色，充斥致密块状沉着物,可遮掩C核37第37页第37页ALP活性能够用阳性率或阳性强度表示。但阳性率不能判别两种不同状态。因此需用积分法表示阳性强度，才干作出

18、准确判断。见下表：用阳性率表示时，无区别；用积分法表示后，发觉呈明显区别。此法是估量法半定量技术。02038第38页第38页（3）发展趋势： 一是更准拟定位：电镜细胞化学 二是更专一定位：免疫组织化学 三是更准拟定量：定量细胞化学（4）定量细胞化学当前惯用仪器与技术：显微分光光度计、显微荧光光度计、流式细胞光度计、电镜X射线显微定量分析技术、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）以及图像分析技术等。39第39页第39页五、影响酶活性基本条件酶组织化学办法四个环节：第一 ：酶固定(fixation)。第二：酶特异性反应（specific reaction)。第三：在最适条件下，酶反应产物沉着(pric

19、ipitation)。第四：使沉着产物含有可见性(visualization)。40第40页第40页组织、细胞标本制备环节41第41页第41页(一）固定和切片标本制作1、固定剂性质：（1）既要保持组织细胞微细结构又要保持酶活性。（2）既不能溶解酶也不能使酶活性部位发生移位。（3）既不能克制酶反应也不能和其它步骤使用试剂发生反应，引发人为产物。 因此要依据酶不同性质选择固定液种类。酶对任何固定液都是敏感。42第42页第42页2、固定对酶活性影响：43第43页第43页3、切片厚度对酶活性影响切片厚度：60m时容易出现人工假象，浸透速度减慢。切片厚度在40m下列时，反应液在切片内部渗入均匀，并较为彻

20、底，切片也能得到充足漂洗。（2）孵育液扩散常数与浓度决定着从组织外向组织内渗入速度，如捕获剂Pb2+在50m厚切片孵育时，需时1分钟才干达到内部，因此切片宜薄不宜厚。44第44页第44页（二）缓冲液选择和调整机制1、缓冲液作用： 缓冲液含有缓冲机体外来少许强酸和少许强碱而不易引起溶液pH值改变作用。因此组织化学孵育液或染液都必须用缓冲液配制，以确保其适宜pH值。 缓冲液之因此含有缓冲作用，是由于它同时含有足量对抗外来强酸和强碱组分。这种成正确物质组分，合称为缓冲系或缓冲对。缓冲液就是由缓冲对构成液体，比如磷酸二氢钠和磷酸氢二钠这组缓冲对构成了磷酸缓冲液。 45第45页第45页2、缓冲液种类与选

21、择 酶组织化学所需缓冲液种类很多，惯用有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液和二甲砷酸缓冲液等。 使用时可依据所要显示酶类，选择使用不同缓冲液。如有钙离子存在时，最好不用磷酸缓冲液，不然易发生非酶反应；Tris是属于氨基缓冲液，因氨基与醛基易发生化学反应，故二者不能在一起使用。 PBTris-CHOCa2+46第46页第46页（三）温度对酶反应速度影响酶促反应也有一个最适温度，在最适温度两侧其反应速度都比较低。人体组织细胞中最适温度普通为37左右。部分酶反应在430之间仍存有酶活性反应，但其反应速度常是缓慢。 47第47页第47页（四）pH值对酶反应影响1、最适pH值：pH值在酶反应过程中有

22、着极其主要影响。在一定pH值下，酶促反应含有最大速度，称此pH值为酶促反应最适pH值（optimal pH）。以最适pH值为中心，高于或低于最适pH值时，酶反应速度均下降。48第48页第48页最适pH值有时可因底物种类、浓度及缓冲液类型不同而产生改变，最适pH值不是一个常数。大多数酶最适pH值是在内环境pH值范围内。2、几种酶pH值：49第49页第49页3、pH值影响酶活性原因（1）pH过低或过高均会影响酶分子构型，甚至使酶变性、失活。（2）酶活性中心普通只有一个离解状态最有助于底物结合，在此pH值下，酶活性最高，是最适pH值。（3）pH值会影响底物、酶底物复合物离解状态。50第50页第50页

23、（五）捕获剂 capture在酶组织化学反应过程中，捕获剂对酶反应结果含有极其主要作用。捕获剂是十分严格，没有捕获剂就不能形成最后产物，并且它既能促使高效率地进行反应，又不猛烈地损害酶活性。捕获剂有Pb2+、Cu2+、Ba2+等，Pb2+已广泛应用于磷酸酶、酯酶和转移酶等酶反应中。 底物（S） IRP FRP酶分解捕获剂不溶性可溶性Pb、Cu、Ba51第51页第51页长处缺点1、在酸性、中性、碱性广泛领域内均可使用1、Pb2+本身能够和反应产物局部以外部位结合扩散，也含有吸附作用。2、无论是PbS或Pb(PO4)2，其反应物在光镜下均可见3、电镜细胞化学虽经脱水、包埋等过程酶活性有轻度流失，但仍含有较好电子密度。2、 Pb2+本身又是克制剂，对腺苷酸环化酶和尿苷酸环化酶含有克制作用。Pb2+作为捕获剂优缺点52第52页第52页（六）激活剂 activator 但凡能提升酶活性物质，都称为激活剂。激活剂种类较多，可分为三大类： 1、离子：多为金属离子。有时一个激活剂对某种酶能起激活作用，对另一个酶也许起克制作用；有时离子间也有拮抗现象。如Na+ 克制K+激活作用；Mg2+激活酶则常被所Ca2+克制。 2、小分子化合物：一些还原剂，如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等能使酶分子中双硫键还原成硫氢基，从而提升酶活性。