四川省宜宾中学高二人教版生物选修一：5.3血红蛋白的提取和分离课件

1、课题3 血红蛋白的提取和分离 一、基础知识：（一）蛋白质提取和分离原理 （二）蛋白质提取和分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法（三）缓冲液的作用二、实验操作实验步骤样品处理和粗分离纯 化纯度鉴定 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白二、实验操作实验步骤 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白样品处理和粗分离纯 化纯度鉴定蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异： 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力 洗脱：从色谱

2、柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收 集大分子收 集小分子 2凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大

3、小。 影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）缓冲溶液洗脱剂 作用： 配制：调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？1.洗 涤 红 细 胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2.释放血红

4、蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质纯化凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5193.样品的加入和洗脱步骤操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？注意： 色谱柱不能内不能有气泡； 装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶是凝胶装填紧密3.样品的加入和洗脱 1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集缓冲液凝胶注意事项1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗