限制性内切酶课件

1、基因组DNA目的基因基因载体重组体基因重组1分子克隆用工具酶Enzymes for Molecular Cloning2核 酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶3常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶455 G C A A T G C T T A G C C A T C G T T A C G A A T C G G T A核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸酶5限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction end

2、onuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H7限制性酶 概念 命名 作用RESTRICTION ENZYMES 8限制性内切酶 能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，这类酶称为限制性核酸内切酶。认为细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，10 细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，保证其不为外来噬菌体所感染，而自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护。 限制修饰体系（Restriction/Modific

3、ation） 此酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA。 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基.（1）dam甲基化酶（2）dcm甲基化酶甲基化酶：在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应 11 能识别限制酶识别的序列，并把其中的某些碱基甲基化（常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰），属修饰酶类。 经修饰的DNA不再被限制酶降解。 已分离到与许多类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应II类限制酶名称前加一个M表示。 如MEcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3

4、-端的A甲基化(GAm6ATTC)的酶12第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写；第2，3二个字母是该细菌的种名，小写；第4个字母代表株；用大写罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin d 属 种 株 序Haemophilus influenzae d株从流感嗜血杆菌d株中分离到的第3个限制酶前三个字母用斜体表示。以限制酶来源的微生物学名进行命名大肠杆菌（Escherichia coli）R株中分离，EcoR I、 EcoR II、 EcoR V属名 + 种名 + 株/型 + 发现序号14 5- GAATTC-33- CTTAAG -55- GTTAAC-33- CAATTG -5EcoR的识别

5、序列Hae的识别序列15 5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN55NNNNNGTT pAACNNNNN33NNNNNCAAp TTGNNNNN5Hae的识别序列和酶切切口（平端）171970年Smith等流感嗜血杆菌株中分离出HindII和HindIII已分离400余种II类酶商品化的约有一百种实验室常用的二十种18I类 识别位点，并切开之，但识别位点并非严格专一，ATP依赖 II类 识别位点严格专一，并在识别位点内将单链切断III类 识别位点严格专一，但切点不专一，往往不在识别位点内部，ATP依赖 基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶 二、分类

6、19缓冲系统pH7.5，Mg2+，盐浓度（NaCl）高盐：100-150mM 中盐：50-100mM 低盐：0-50mM II类酶的酶活条件：20Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口 每一种限制酶能辨认特定的限制位点(restriction site) 。 多数限制酶不在两股的同一位置（即限制位点中央）切割，产生两个单股尾巴，称粘性末端（cohesive/sticky end)，因为它容易与另一个DNA片段的互补黏端相结合。 有些限制酶从限制位点的正中央切割，所产生的端点叫做平端(blunt e

7、nd) 。它们较不易与其他DNA 片段相结合 。 215 C C C G G G 33 G G G C C C 5SmaIForms blunt ends产生平末端（blunt end) 225 G A A T T C 33 C T T A A G 55 overhang forms cohesive endsEcoRI3. 产生5突出粘性末端24几种常用的限制性核酸内切酶25star activity 限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，降低酶的特异性，这种现象称星号活力/“星”活性。 酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。 EcoR：GAATTC EcoR*：

8、 AATT27 从不同原核生物中分离出来的不同的酶，但有相同的识别顺序，其切割DNA的位点可以相同，也可不同。异源同工酶/同裂酶/同功异源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst28同尾酶酶的来源不同，识别序列不完全相同，但作用(切割)DNA后，能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A29估算RE识别序列在DNA上出现的频率识别序列的频率=1/4N Sau3A(4bp)=1/4 4 256bp EcoRI、PstI(6bp)=1/46 4096 NotI(8bp)= 1/48 65536 (rare cutters) 仅是理论推测30切点出现频率及片断大小3