基因组RNA的复制吕远生工A

1、 基因组RNA的复制吕远2011018099生工A1101提纲依赖于RNA的RNA合成双链RNA病毒的RNA复制单链RNA病毒的RNA复制以DNA为中间物的RNA复制逆转录病毒的RNA复制逆转座子端聚酶催化的逆转录反应某些DNA病毒生活史中的逆转录现象依赖于RNA的RNA合成RdRP主要由病毒基因组编码，有的还需要宿主细胞编码的辅助蛋白合成的方向总是53绝大多数在模板的一端从头启动合成，少数需要合成引物属于易错、高突变合成 对放线菌素D不敏感，但对核糖核酸酶敏感复制的场所绝大多数在宿主细胞的细胞质，少数在细胞核 正链RNA和负链RNA基因组的复制 逆转录病毒的发现上世纪60年代，Howard

2、Temin观察到某些RNA病毒的复制和增殖受到DNA复制和转录的抑制剂放线菌素D的抑制，于是他大胆地推测到这些病毒的生活史中有DNA中间物的存在或者有从RNA到DNA的逆转录过程。1970年，Temin和David Baltimore 各自从RNA肿瘤病毒中纯化到催化以RNA为模板合成DNA的逆转录酶，为逆转录现象的存在提供了最直接的证据。Termin和Baltimore的发现使“中心法则”不得不进行修改，加上了逆转录内容。 逆转录病毒与癌基因所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒RNA病毒中的癌基因是宿主细胞正常癌基因的变化形式 逆转录病毒的例子：劳氏肉瘤病毒（RSV）猫白血病病毒小鼠乳房癌病毒

3、艾滋病毒（HIV）逆转录病毒的RNA复制 逆转录病毒的结构逆转录病毒的生活史附着与融合核心颗粒释放和逆转录原病毒DNA进入细胞核整合转录及后加工转录物输出到细胞质翻译及翻译后加工新病毒装配和出芽释放 逆转录病毒的结构逆转录病毒的基因组RNA的结构逆转录病毒的基因组RNA等同于一个全长的病毒mRNA，其非编码序列包括5端的帽子结构、5端的末端直接重复序列（R）、5端特有的序列（U5）、引物结合位点（PBS）、剪接信号、引发第二条链合成的多聚嘌呤区域（PPT）、3 端的多聚腺苷酸尾巴、3 端特有的序列（U3）和3端的末端直接重复序列。编码序列通常含有3个结构基因，它们是编码MA、CA和NC的gag

4、基因，编码逆转录酶、整合酶和蛋白酶的pol基因以及编码SU和TM的env基因。如果是肿瘤病毒，还含有编码癌蛋白的癌基因onc。逆转录病毒基因组的结构HIV-1 基因组双倍体：每一个拷贝的RNA大小= 9 749 nttRNALys引物与每一个RNA结合5-帽子+3-Poly A尾巴；编码9种蛋白质帽子-R-U5-PPT-(10个ORF)-U3-R-Poly A原病毒 (2XDNA) 的LTR: U3-R-U5 = 634 bp U3 = 453bpR = 98bpU5 = 83bp逆转录病毒的生活史HIV的附着与融合 这是由受体和辅助受体介导的病毒颗粒外被与宿主细胞膜先特异性附着、后融合的过程

5、。作为受体和辅助受体的分别是CD4蛋白和趋化因子受体CCR5或CXCR4，而配体是病毒表面糖蛋白gp120和gp41。 HIV的宿主细胞主要包括：CD4-T淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞，这些细胞都含有CD4蛋白和趋化因子受体。艾滋病毒与宿主细胞的附着艾滋病毒外被与宿主细胞膜的融合HIV-1病毒的附着与融合CD4趋化因子受体宿主细胞膜gp120gp41病毒外膜融合肽NCNC核心颗粒释放和逆转录 当HIV-1外被与宿主细胞膜融合以后，由衣壳包被的基因组RNA进入细胞质，随后在与基因组RNA结合的逆转录酶的催化下开始逆转录。逆转录病毒两种形式的差异RNA R U5 GAG POL ENV

6、 U3 RLTR重复序列重复序列DNAU3 R U5 GAG POL ENV U3 R U5LTR逆转录酶的结构与功能具有三个酶活性：（1）53 的依赖于RNA的DNA聚合酶活性，该活性用来催化负链DNA的合成；（2）核糖核酸酶H活性，该活性用来水解tRNA引物和基因组RNA；（3）5 3 的依赖于DNA的DNA聚合酶活性，该活性用来合成正链DNA。逆转录酶的聚合酶活性与其它聚合酶一样位于由三个结构域折叠成的“手掌-手指-拇指” 模体之中，但核糖核酸酶H活性位于另外一个结构域之中。使用RNA聚合酶II拷贝逆转录基因组的问题后果: 新拷贝的病毒RNA变短-缺乏控制元件 启动子病毒 RNA逆转录酶

7、 R U5U3 RU3 R U5U3 R U5形成长末端重复序列RNA起始位点RNA终止位点POLIIPOLII逆转录病毒只有一个启动子（包含在U3）逆转录病毒基因组逆转录的详细过程原病毒DNA进入细胞核逆转录产生的原病毒DNA单独并不能进入细胞核，它先需要与病毒蛋白VPR、MA和IN一起组成核蛋白的形式，然后在位于IN上的细胞核定位信号（NLS）的指导下通过核孔进入细胞核，此外，在逆转录过程中形成的一小段三链病毒cDNA上的中央翼式结构在其中可能也起一定的作用。 原病毒DNA进入细胞核的机理原病毒DNA的整合整合是病毒cDNA与宿主染色体DNA的共价连接，整合位点是随机的。整合的病毒cDNA

8、将成为受感染细胞的永久性遗传物质，它随着宿主DNA的复制而复制，从而传给子细胞。具体的整合反应是：整合酶首先在距离两端LTR3-端2个核苷酸的位置切开LTR丢掉2个核苷酸，产生隐缩的3-端，同时在宿主细胞的DNA上交错切开，然后将原病毒DNA隐缩的3-端和宿主细胞DNA突出的5-端连接起来。最后由宿主细胞内的修复系统将空缺填补，完成整合过程。原病毒DNA的整合转录及后加工HIV的转录是在宿主细胞RNA聚合酶II催化下完成的，其全长初级转录物的长度为9kb。转录开始于U3-R 的连接点。然而，如果没有Tat蛋白，RNA 聚合酶II复合物的进行性不足，转录虽然仍以正常的速率进行，但将终止于+80n

9、t的位置，转录物仅仅是长为70nt左右 的TAR序列，而非全长的基因组大小的RNA；如果有Tat蛋白与TAR结合，则通过招募周期蛋白和依赖于周期蛋白的激酶9（CDK9）到近启动子位置，促进CTD的高度磷酸化，有利于启动子清空，增强聚合酶II的进行性，使RNA聚合酶能够合成全长的初级转录物。艾滋病毒原病毒DNA转录的抗终止作用GAG、GAG-POL和ENV的形成RNA前体的不同命运逆转录病毒的RNA转录物像宿主细胞的mRNA前体一样经历同样的后加工反应，包括戴帽和加尾，剪接有的发生，有的不发生。成为子病毒基因组RNA，加上tRNALys翻译成GAG多聚蛋白质通过翻译后移框产生GAG-POL剪接成

10、ENV的mRNA发生选择性剪接，产生多种类型的mRNA，以编码除了env基因产物以外的病毒特有的调节蛋白和辅助蛋白 艾滋病毒基因组RNA含有的可能剪接位点转录物输出到细胞质剪接完全的转录物与宿主细胞的剪接好的转录物使用同样的机制离开细胞核，但没有剪接的或仅发生单一剪接反应的依然含有多重剪接信号的mRNA需要一种含有细胞核输出信号（NES）的Rev蛋白。Rev与没有剪接的RNA上的发夹结构Rev反应元件（RRE）结合，其NES被CRM1识别。剪接不完全的逆转录病毒mRNA离开细胞核的机制翻译及翻译后加工逆转录病毒使用多聚蛋白质提高其基因组的编码能力所有的逆转录病毒都可以产生三种多聚蛋白质即多聚G

11、AG、多聚GAG-POL和多聚ENV，剪接过的或非剪接过的mRNA在从细胞核运输到细胞质后都可以作为模板进行翻译。其中9kb转录物被正常翻译成多聚GAG或经移框翻译出多聚GAG-POL融合蛋白。这两种多聚蛋白在病毒组装过程中被多聚GAG-POL上的蛋白酶结构域切割成各种蛋白质单体。其中多聚GAG可产生MA、CA和NC等几种病毒内部结构蛋白。 一种剪接过的mRNA（含有env基因）被翻译成gp160多聚蛋白，并进入内质网进行糖基化修饰，在高尔基体被宿主细胞的蛋白酶剪接成gp120和gp41，将来分别成为SU和TM。多聚GAG-POL除了产生MA、CA和NC以外，还能产生蛋白酶、逆转录酶和整合酶。

12、多聚GAG-POL的量要远远小于多聚GAG的量，因为作为对酶分子的需求显然小于对结构蛋白的需求。新病毒装配和出芽释放GAG与GAG-POL的内部核心自发装配成“颗粒”；两个拷贝的9kb长的基因组RNA随着GAG之中的NC部分与病毒RNA上的包装序列结合进入颗粒之中。GAG和GAG-POL上的Myr-MA部分指导复合物，到达插有gp120-gp41复合物的细胞膜上。颗粒与内部的gp41结构域结合，并开始出芽。在出芽期间或出芽以后，GAG 和GAG-POL 被病毒的蛋白酶切割，成为各种单体，其中蛋白酶、逆转录酶和整合酶与基因组RNA相连，其它结构蛋白构成衣壳包裹基因组RNA。在出芽过程中，含有gp

13、120-gp41的细胞膜包被在病毒颗粒的最外面。在颗粒释放以后，GAG和GAG-POL继续切割。病毒蛋白酶虽然不是病毒装配所必需的，但却是病毒成熟和获得感染性所必需的。现在，HIV蛋白酶的抑制剂已成为抗艾滋病鸡尾酒疗法中的标准成分。艾滋病毒完整的生活史艾滋病的混合疗法或鸡尾酒疗法各种逆转录元件某些DNA病毒生活史中的逆转录现象某些DNA病毒，例如花椰菜镶嵌病毒（CaMV）、乙型肝炎病毒（HBV）和其它一些嗜肝DNA病毒，尽管遗传物质是DNA，但其生活史中也有从RNA到DNA的逆转录过程。这些DNA病毒被称为泛反转录病毒乙型肝炎病毒的生活史细菌内发现的逆转录事件逆转录也发现在粘球菌、大肠杆菌和一些革兰氏阳性杆菌（如根瘤菌）之中。这些细菌体内存在一种奇怪的核酸被称为msDNA。该核酸是通过特殊的逆转录反应