化合物专一性同位素分析应用中的计量原理

1、第10章.化合物同位素分析技术中的计量原理 1.前言 化合物单体同位素分析 技术，在对环境中污染研究 中，是一种示踪污染来源， 定量降解过程和了解降解机 制的重要手段。通过描述化 合物转化过程同位素分馏效应与反应进程关系的瑞利方程，1） 可以直接测定污染物转化降解的 进程；2）由实验确定的表观动力学常数，当与理论预期的动力学常数相比较时，便可以判定同位素效应的决定性反应步骤，因而推论反应机制；3）利用扩展的瑞利方程，可以判定一个底物是否存在多代谢途径，并估计每一途径的相对贡献。 虽然该技术线路早已建立，但因受限于同位素容量分析的灵敏度，只有在单体同位素分析成为可能之后才得以实现。目前单体同位素

2、分析常用两种方法，一是对化学键位置灵敏的核磁共振谱测定，但该方法需纯的样品，且样品含量要求较大，因此对复杂基质且低浓度的环境样品常需采用目前最有前景的方法，即单体同位素分析技术。2.同位素分析及装置气象色谱-燃烧-同位素质谱(GC-C-IRMS) -主要进行易挥发化合物的同位素分析 图.GC-C_IRMS结构示意 装置基本结构如图所示，由气谱通过燃烧单元耦合到质谱而构成，氧化炉由盘有CuO、NiO和Pt丝的无孔铝管组成，氧化剂CuO、NiO在催化剂Pt的催化下，将有机物氧化成CO2、H2O和氮氧化物，然后导入填充Cu的还原炉，使氮氧化物还原成N2。液相色谱-氧化-同位素质谱(LC-C-IRMS

3、) -可进行一般溶液中有机化合物的测定 图.LC-IRMS 工作流程示意。分析物由LC分离，在磷酸存在下由过硫酸钠定量转化为CO2,所产生的过量O2，随后在还原炉使Cu氧化而被移去，以免腐蚀后面离子源的灯丝。 图.LC-IRMS装置结构示意3.基本化学计量关系3.1同位素的基本计量相对比率 化合物中元素重同位素对轻同位素的原子比率相对于标准物质的相对值，并用小写delt符号,单位为千分数表示，即 （） （1） 式中，R 分别是化合物X和标准std中的重同位素对轻同位素的比率。关键元素同位素的基础数据有机污染物中关键元素的稳定性同位素的自然丰度比率同位素 比率（%） 测定 M/Z 检测限 （nm

4、ol） 精度（）2H/H 0.01558 H2 2,3 810 513C/12C 1.123 CO2 44,45,46 1 0.215N/14N 0.366 N2 28,29,30 0.8-1.5 0.518O/16O 0.204 CO 32,33,34 5 0.835S/34S 4.21 SO2 64,66 n.a n.a37Cl/35Cl 31.96 分子 离子系列 0.3分馏因子 表示化学反应中同位素分馏效应的物理量，用产物相对反应物（或底物）的相应同位素比率表示，即 （2） 富集因子 分馏效应的另一种表示方式，又称为容量分馏因子，表示为 （3） 效应解析 由于同位素在其化学反应进程中活

5、化能不同，因此在涉及化学键断裂或形成的反应中，同位素因动力学反应速率不同而产生分馏效应，对于仅含一个单元素原子的小分子,如CCl4的碳等，有 （4） 式中 ， 和 分别为化合物的重或轻同素体的反应速率常数； 用以描述反应的动力学效应。 同位素效应的机制图.两同素体在反应进程中振动势能曲线的比较。ZPE代 表零点能，蓝色和红色分别代表轻、重同素体，两者的零点能之差，反应态大于过渡态及形成态，因此产生同位素效应，并且称为正效应，重同位素在反应物中富集。 化学键的同位素效应，是由同位素的反应活化能不同而反应速率所不同引起，活化能取决于化学键在反应态和过渡态间零点振动能的差别。振动能为E=h，其中h是

6、普朗克常数， 是键的振动频率， ，其中是键的配对体的约化质量，重同位素的较小，因此零点能较低，f是键的力常数，过渡态时较小，势能较浅，振动能的量子间距也较小。 3.2瑞利方程(Rayleigh equation) 是将化学反应的进程，即反应底物的剩余分数，通过同位素富集因子，与因反应进程中因同位素分馏效应而致底物同位素比率的变化相联系的方程。其数学推导如下： 根据分馏因子的定义，即同位素在产物与反应物之间的分配比，有 （5） 式中，H和L分别为化合物重同位素体分子和轻同位素体分子的浓度，下角标p和r分别表示产物和反应物。因为， 和 所以， （6） 积分上式，且此后省略下角标 r，有 （7）令

7、（8）表示反应物的剩余分数。对方程（7）进行变化，有 （9）整理上式，有 （10） 式中， 和 分别为反应物在t 时刻和0时刻时,重同位素对轻同位素的比率。 当重同位素体的浓度很低，即 或分馏效应很小，有 ，此时方程(10)可近似为经典的瑞利方程，即 （11） 用对数线性化表示，有 （12） 对于转化过程，富集因子的典型值为 ,此时有 （13） 方程(13)可以简化为： （14） 从方程(1)和(3)可得出，产物与反应物间的 差值等于对反应物归一化的富集因子 ，即 （15） 举例举例 反应进程中同位素漂移量及分析误差与可靠性判定的关系 分析不确定性对甲苯降解判定的影响。 a.甲苯的甲基或环氧化

8、途径； b。通过甲基途径，降解超过15%，同位素漂移就会超过分析的确定性0.5，因此可以判定该过程；而对于环氧化途径，只有降解超过70%，才可判定。 3.3瑞利方程的解析与修正 实际上在利用瑞利方程时，由测定所确定的同位素富集因子，常称为容积富集因子 ，它是对整个分子中相应元素所有原子平均的结果，为了将其与化学反应的同位素动力学效应关联起来，以便将实验得到表观动力学常数AKIE，与理论推导的动力学常数KIE相比较，以推测化合物转化途径的化学机制，首先因用所谓的反应位置富集因子 替换容积富集因子 ，为此对瑞利方程进行如下修正。 对分子间竞争的修正 由瑞利公式的推导过程可知，其为分子同素体分馏效应

9、与反应进程关系的方程，然而由质谱测得的是元素的同位素丰度，而并非分子同素体的丰度，除了单位点元素原子分子，如CCl4中的C等极个别的情况，同位素的分布才等同于同位体的分布外，对其它更一般情况，即分子中元素同时存在于非活性反应部位时，则必须将测得元素的同位素比率转化为分子同素体的比率。说明四氯乙烷降解途径及反应原子的例子 图.四氯乙烷脱氯的可能途径，以及适合CSIA分析的反应键和元素原子。 设化合物中的相应一元素含n个原子，其中x个的是反应位点等价的，在考虑分子的同素体时，因重同位素的自然丰度很小，一般只需考虑全为轻同位素lEn ，或仅有一个重同位素hElEn-1 的两种分子，对于反应过程的同位

10、素效应 ，只有重同位素处反应位点才发生，而在非反应位点时对分馏没有贡献，表观上表现为因分子间非位点与位点竞争，而致分馏效应的被稀释，此时元素同位素丰度和同素体丰度有如下关系，即 (16) 式中， R是同位素比率，而 K是同素体的比率。因此考虑因分子间非反应位点对反应位点同位素分馏的竞争稀释作用，瑞利经典瑞利方程修正为 （17） 式中， rp和 rp分别称为反应位点分馏系数和富集因子，位点富集因子与容量富集因子有近似关系rp=(n/x)bluk。对分子内竞争的修正 对于分子反应位点有z个内等价原子的情况，因轻同位素的反应不产生分馏，而会对重同位素分馏产生稀释作用，考虑此校正的单位键的富集因子应增

11、加z倍。考虑以上两种修正，所表观动力学常数的所测得富集因子有以下关系，即 （18） 在实际应用过程中，针对某一具体的反应过程，可以通过测定其表观动力学常数，并与推测的反应途径所求得内在动力学常数进行比较，可用以阐述反应机制及途径。 3.4扩展的瑞利方程 当底物的代谢有多个途径，且都遵循一级反应动力学时，同时考虑到 ，则分子的轻和重同素体浓度变化，可分别表示为 （19） 和 （20） 式中， L和H 分别为轻和重同素体浓度， K为一级反应速率常数， 为分馏因子，上角标 L和 H分别表示轻或重同位素，下角标1和2分别表示每一过程。 积分方程（12）和（13），同时考虑此后省去k的上标L有 （21）

12、 和 （22） 方程(22)除以（21），并利用同位素比率表达， 有 （23） 式中， 和 分别是，底物在t时刻和初始时的同位素比率。当重同位素的处于自然丰度，浓度很低或分馏效应较小时，方程（23）可改写为： （24） 式中，f为反应物的剩余分数 ，A为表观分 馏因子。 若令 ，则 ， 由上式可见，如果只有一个代谢途径，即 或 ，则方程（24）即退化成经典的瑞利方程。 当有 个代谢途径时，由扩展方程（24），有 （25） 对二维同位素分析进行进一步讨论，以13C和2H为例，由（4）式有 （26） 令 （27） 重排求解，有 （28） 由 （29a） 有 （29b） 最终底物剩余分数，可以表示为

13、 （30） 底物被降解的百分数为 （31） 3.5生物降解的动力学 生物降解过程通常并不严格遵循一级动力学方程，但认为可以由莫诺动力学方程予以描述。莫诺方程（1949）最初用以描述当底物为唯一的碳源时其降解速率的方程，即 （26） 式中， 是生物对底物的最大相对消费速率（day-1 ）， S是底物浓度（mg/L )，B是生物浓度（ mg/L），Ks是半饱和消耗浓度常数（ mg/L），假设生物量保持恒定，则 Vm相应底物的最大利用速率（mg/L.day）。 由于莫诺方程为非线性方程，不能如一级动力学方程一样对同位素分馏给出类似瑞利公式的显式表达式,为此采用简化近似的办法，在底物存在着两种生物降解

14、途径情况下，类比方程（23）中的定义，用底物浓度S 相乘，即 （27a）或 （27b）将方程（26）代入（27），有 （28） 如果 ， 则 ， 此时相应于伪零级反应，方程(28)可简化为 （29） 而如果 ，则 ，速率此时近似于伪一级反应，方程(21)可简化为 （30） 由（29）和（30）两式可见，表观分馏值 ，在底物的浓度高或低时，趋近于不同的常量，但在中间浓度时,随底物浓度而变。4.瑞利方程的实际应用 图.实验流程。上部为传统的应用瑞利方程过程；下面是 修正和导出表观动力常数过程。4.1污染物降解过程分析1）单纯降解的过程分析 在野外情况下，基于质量平衡原理分析污染物的消解过程，必须对

15、水文地条件要有充分了解，并需进行长期的取样监测，费时费力且花费巨大，同时进行底物浓度测定时，因其会受到非真正消解过程，诸如稀释、吸收及蒸发等作用的影响，因此要准确测定污染的降解过程面临极大困难，然而利用瑞利方程，在预先由实验室培养或野外控制条件实验，在得到实际过程同位素富集因子的实验值后，只需测定污染物中的同位素信号，以排放源处作为参考点，在污染水羽的时空点上取样，就可得到关于降解过程的定量结果。举例 L U C Z W A N K. New Evaluation Scheme for Two- Dimensional Isotope Analysis to Decipher Biodegra

16、dation Processes: Application to Groundwater Contamination by MTBE. Environ. Sci. Technol. 2005, 39, 1）实验布置 图.示MTBE沉降池、监测井和地下水流。PM04为沉降池，附近另有苯酚和其它有机物的渗滤池。2）结果分析图.MTBE污染的羽流及同位素信号图.MBTE主要降解产物TBA羽流及同位素信号基本结果： 1）沉降源PM04的污染羽流长度500m，随水头浓度持续减少，同位素持续富集； 2）浓度减少和碳同位素富集模式间相关不明显（R2=0.25，文献中图3），说明存在有其它不产生同位素富集的稀

17、释过程，因此田间因降解的消除率，必须由瑞利方程得出； 3）在PM04处MTBE浓度最大，而TBA在探测限以下，但随水头增加，说明其不是MTBE的共沉降物，而是其主要的降解产物。 4）为了判定MTBE是好氧还是厌氧降解，采用双同位素示踪法，依据对碳富集因子的公认值，好氧时为=-1.82 ，厌氧时=-8.62 ，先由测样值13C计算剩余分数f，再建立2H与f的关系，相关系数R2=0.94，说明方法是适合的。由作图的斜率可知，得到的氢的富集因子为，好氧时=-3.3 ，厌氧时=-15.6%， =-3.3 太低与报道不符，计算的f不能合理解释，而=-15.6%与报道值一致，计算的f值也必将合理，所以认为

18、MTBE主要是厌氧降解。 2)多降解途径的解析 当底物降解存在竞争途径，为了解析各途径对降解的相对贡献时，可利用扩展的瑞利方程。以（C，N）为分析同位素对，及氧化和部分还原两个竞争过程为例，则氧化过程对降解的贡献为 而底物在转化过程中的剩余分数，可利用扩展的瑞利方程，由测定的某一同位素分馏显著的元素的计算得到。例.硝基苯的氧化与还原同时发生时的同位素信号 图.底物硝基苯中13C和15N同位素信号在其氧化（red）和还原（blue）中的变化曲线。图中阴影部分为对某一单独的机制， 是由对测量数据线性回归得到，实线代表两过程以相应比例，即3：1,1:1和1:3发生时的同位素信号变化，虚线表示硝基苯的

19、降解程度，开始时为4.2污染物降解机制研究 1）由动力学常数确定 底物的同位素的漂移，缘于化学转化过程中，速率限制步骤的化学键裂解时所产生的同位素动力学分馏效应，因此由利用瑞利方程求得的表观动力学常数，与推测的某种机制下的理论动力学常数比较，可以推断实际过程的反应机制。例.甲基叔丁醚的降解机制 甲基叔丁醚(MTBE)可能降解途径包括：甲基氧化、SN-2水解，SN-1水解。酸水解的瑞利方程线性作图如图示。 图.MTBE酸性水解，（a，b）对容积平均富集因子H,bluk和C,bluk;（c，d）对反应位置富集因子H,rp和C,rp。MTBE酸解途径推测 在SN-1途径，对C，n=5，x=1，z=1；对H，效应为次级效应，n=12，x=9，z=1。反应位置校正后的富集因子分别为c=-24.3 2.3 ，H,bluk=-73 9 。由此求得动力学常数为KIEc=1.025 0.003，KIEH=1.08 0.01，与报道的该机制下反应键的动力学常数一致，说明其为SN-1途径。例.硝基苯的好氧降解 降解途径 培养实验 用修改的无氮基本培养基，补充硝基苯（0.5-1.0mM）作为唯一氮源。实验结果 例：对于注解a，有 4.2双同位素绘图法 环境中污染物的降解往往是一酶促的，要经历连续性的