转染抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR751细胞的细胞周期和增殖能力的影

1、转染抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR751细胞的细胞周期和增殖本领的影李祥勇，林不雅平，周克元【关键词】人乳腺癌zr【摘要】目的：不雅察ptenphsphataseandtensinhlgydeletednhrseten，第10号染色体上磷酸酶和张力卵白同源缺失的基因对人乳腺癌细胞zr751细胞增殖和细胞周期的影响。要领：使用脂质体介导法将携带有野生型和突变型ptendna的真核表达载体pbptpten和pbpg129rpten导入人乳腺癌zr751细胞质粒转染乐成后实行分为tpten组、g129rpten组和未转染质粒组即比拟组后，以rtpr、esternblt阐发目的基因的表达，并接纳tt法

2、和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期。效果：tpten组、g129rpten组细胞ptenrna及pten卵白出现显着的高表达。tpten组细胞生长的按捺率可高达42.7%，与比拟组比力，差异有明显性(p0.05)。但g129rpten组细胞生长的按捺率与比拟组比力，差异无明显性(p0.05)。流式细胞术表现tpten组细胞周期从g1期到s期已产生按捺。结论：野生型pten可依靠其磷酸酶活性按捺肿瘤细胞的增殖，并终极诱导细胞凋亡。【关键词】人乳腺癌zr751细胞；pten基因；细胞周期【keyrds】zr751;pten;ellyle;prliferatinptenphsphataseandte

3、nsinhlgydeletednhrseten，第10号染色体上磷酸酶和张力卵白同源缺失的基因是继p53基因之后新近创造的与种种肿瘤严密相干的一个抑癌基因，其突变与缺失见于多种恶性肿瘤，如前线腺癌、胶质瘤、乳腺癌等。如今创造pten是唯逐一个编码具有双重磷酸酶活性的抑癌基因1，因其依附磷酸酶活性负调控pi3k/akt信号传导途径而备受存眷。虽有研究表白，pten的缺失与突变与乳腺癌的产生生长严密相干2，然而如今有关pten基因对乳腺癌细胞生长按捺的作用多会合在对乳腺癌构造的研究，而pten基因转染对人乳腺癌细胞的研究不多。本实行以外源性pten基因导入该基因内源性缺失的乳腺癌细胞zr751中，

4、通过rtpr、esternblt阐发目的基因的表达；同时接纳tt法和流式细胞术检测转染后pten基因对zr751细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，以探究其在乳腺癌细胞株生长按捺历程中的作用机制。1质料与要领11质料人乳腺癌细胞株zr751由中国医学科学院底子医学研究所提供。pbptpten及pbpg129rpten质粒由美国加州大学ludig癌症研究所furnari传授惠赠。胰卵白酶为美国gib公司产物，胎牛血清为杭州四序青微生物质料工程公司产物。trizl试剂购自美国invitrgen公司，嘌呤霉素、dnaladder、dep、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等购自美国siga公司。rtpr反响试剂盒

5、购自qiagen公司。小鼠抗人pten单克隆抗体、山羊抗人atin多克隆抗体、exl发光试剂盒购自santaruz生物技能公司。hrp标识表记标帜山羊抗小鼠igg、hrp标识表记标帜马抗山羊igg等别的试剂购自北京中山生物技能等海内公司。pten、gapdh引物由上海生工公司合成。12要领2效果2.1pten基因乐成转染接纳脂质体介导法，将质粒pbptpten和pbpg129rpten转染入zr751人乳腺癌细胞中，经嘌呤霉素连续挑选，得到阳性转染的细胞克拢2.2rtpr检测ptenrna的表达程度紫外灯下可见，tpten细胞和g129rpten细胞373bp处有清楚豁亮的条带，而zr751细

6、胞373bp处条带模糊，3组细胞泳道在226bp处均出现豁亮的条带(见图1)。说明zr751细胞ptenrna只有少量表达，而tpten组和g129rpten组细胞中ptenrna出现高表达。：100bpdnaarker;a:zr751细胞；b：g129rpten细胞；：tpten细胞图1转染pten前后ptenrna的表达2.3esternblt检测pten卵白的表达程度由图2可见，tpten细胞和g129rpten细胞具有显着的pten卵白条带，而zr751细胞pten卵白条带不显着，效果说明，zr751细胞pten卵白表达程度非常低，而转染后pten卵白程度出现高表达。a:zr751细胞

7、；b：g129rpten细胞；：tpten细胞图2转染pten前后pten卵白的表达2.4差异表达质粒按捺肿瘤细胞增殖环境tpten组与比拟组比力，细胞增殖显着受到按捺按捺率为42.7%，(p0.05)；而g129rpten组细胞增殖与比拟组比力差异无明显性p0.05，见表1。表1突变型与野生型pten质粒对zr751细胞增殖的影响2.5外源性pten对zr751细胞生长周期的影响流式细胞仪检测细胞周期表现,tpten组与比拟组比力，g1期细胞数由54.52%增长到63.17%，s期细胞数由36.51%变为31.15%，提示从g1期到s期产生按捺。而g129rpten组与比拟组比力，差异无明显

8、性p0.05，见表2。表2外源性pten对zr751细胞周期的影响3讨论癌基因的激活和抑癌基因的失活，是如今较为公认的肿瘤产生生长的紧张机制3。已有研究创造多种抑癌基因如p53、p16、p21等在脑胶质瘤等肿瘤中存在有缺失、突变或非常低表达等改变，且表达量随肿瘤恶性程度的增高而低落4。pten基因自觉明并克隆以来作为一种与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移等生物学特性严密相干的抑癌基因已成为当前研究的热门。pten编码403个氨基酸残基组成的卵白质5，其氨基端1185是活性中央，含有一个双重底物特异磷酸酶的布局域，即具有卵白磷酸酶和脂质磷酸酶的活性。前者可使酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸的残基脱磷酸化，在多种

9、途径和细胞周期中发挥作用。pten卵白还可依附其脂质磷酸酶活性，特异地使磷脂酰肌醇三磷酸ptdins(3,4,5)p3的3磷酸脱去6，使ptdins(3,4,5)p3变化为ptdins(4,5)p2，调治第二信使ptdins(3,4,5)p3的程度，按捺pi3k/akt信号转导途径，导致细胞信号转导和细胞生长周期的停滞，进而调控细胞的生长，并终极诱导细胞凋亡7。本实行所用的野生型pten表达质粒pbptpten和磷酸酶活性缺失型pten表达质粒pbpg129rpten都是将全长为1212bp的人pten基因的dna毗连到pbp载体上构建而成，两者的区别在于，pbptpten质粒中毗连的是具有磷

10、酸酶活性的野生型pten基因，而pbpg129rpten质粒中的pten基因是突变型基因，此基因因其磷酸酶活性的124位点产生点突变而致其失去脂质磷酸酶和卵白磷酸酶活性。esternblt检测效果表白，转染pbptpten质粒和转染pbpg129rpten质粒组的细胞均出现有pten产物卵白的高表达，其表达程度与比拟组比拟，差异有明显性p0.05,说明两种pten质粒转染到人乳腺癌细胞zr751均能进步pten卵白的表达程度。rtpr效果进一步证明了两种表达质粒转染人乳腺癌细胞zr751后，能有用地进步ptenrna的表达，进而促进pten卵白的高表达。别的，在细胞增殖方面，本文效果表现：tp

11、ten组与g129rpten组、比拟组比力，差异均有明显性；别的，我们还对证粒空载细胞增殖作过不雅察，其效果与zr751组比力差异无明显性8。从而去除了载体对细胞的毒副作用，表白转染野生型pten基因是按捺肿瘤细胞生长的重要缘故原由。流式细胞术的效果表白，pten转染组细胞增殖停滞于g1期，而且细胞凋亡显着增长。说明pten促进肿瘤细胞凋亡是其抑癌机制之一。我们在接纳野生型pten基因转染的同时，以突变型pten基因作比拟，后者的突变位于磷酸酶活性中央并使其失去磷酸酶活性。效果表现，野生型pten基因转染具有按捺肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡及引起细胞周期产生停滞的作用。而突变型pten基因转染那

12、么没有如许的作用，说明pten基因磷酸酶活性的缺陷大概是引起成效差异的重要缘故原由，故以为pten的抑癌作用与磷酸酶活性有关。以上效果表现，pten基因大概通过pi3k/akt途径使zr751乳腺癌细胞产生细胞周期的改变、按捺其体外增殖。这好似为乳腺癌的基因治疗提供了新的思绪。参考文献：1aiteka,eng.prteinpten:frandfuntinj.ajhugenet,2002,70(4):829844.2bses，ranea，hibshshh，etal.reduedexpressinfptenrrelatesithbreastanerprgressinj.hupathl,2002,3

13、3(4):405409.3zhuy,hingyp,kkkh,etal.psttransriptinalsuppressinfgeneexpressininxenpusebrysbysallinterferingrnaj.nuleiaidsres,2002,30(7):16641669.4tahibanai，sithjs，satk，etal.investigatinfgerlinepten,p53,p16(ink4a)/p14(arf),anddk4alteratinsinfailialgliaj.ajedgenet,2000,92(2):136141.5lij，yen，liad，etal.pten，aputativeprteintyrsinephsphatasegeneutatedinhuanbrain，breast,andprstateanerj.siene，1997,275(5308):19431947.6degraffenriedla，fulherl，friedrihse，etal.reduedptenexpressininbreastanerellsnferssuseptibilitytinhibitrsfthepi3kinase/aktpathayj.annnl,2022