核酸扩增技术

1、核酸扩增技术第1页主要内容第一节 聚合酶链反应技术第二节 荧光定量PCR技术第三节 其它核酸扩增技术第四节 临床基因扩增试验室管理与质量控制第2页第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR一、 PCR技术发展简史二、 PCR技术原理三、 PCR反应体系、条件及其优化四、 扩增产物检测及分析五、 PCR常见问题与原因分析六、 PCR衍生技术第3页PCR技术发展简史1985年Kary Mullis等创造了含有划时代意义聚合酶链反应，使用DNA聚合酶是Klenow片段。1986年Randall Saiki 发觉taq dna聚合酶，从此pcr技术得以广泛应

2、用。(1993年诺贝尔化学奖取得者) 第4页基本原理 第5页PCR反应体系、条件及其优化PCR反应体系模板（template）引物（primers）DNA 聚合酶 (DNA polymerase)dNTP(atp, CTP, TTP, GTP) PCR缓冲液（PCR buffer）PCR反应条件变性退火延伸循环第6页DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板（Template）第7页引物(primers)引物是人工合成两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端另一条DNA模板链互补。3355Fo

3、rward primerReverse primer第8页引物主要性在整个PCR体系中, 引物占有十分主要地位。PCR特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其它非目标DNA结合，PCR灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效延伸，可见引物设计好坏与PCR结果亲密相关。第9页引物设计总标准引物与模板序列要紧密互补引物与引物之间防止形成稳定二聚体或发夹结构引物不能在模板非目标位点引发DNA聚合反应(即错配) 第10页引物设计普通标准引物长度 碱基分布均衡性Tm值引物二级结构引物3端引物5端引物内部稳定性引物保守性与特异性扩增区域二级结构第11页引物长度 普通为15-30个核苷酸，惯用是18-24 b

4、p。在做长片段PCR或做一些特殊PCR时应使用较长引物，但最多不超出50个核苷酸引物过短会引发错配现象，普通来说引物长度大于16 bp是必要（不轻易引发错配）较长引物（28-35bp)普通是用来区分同源性较高模板序列或者使用于产生一些突变位点第12页碱基分布均衡性GC含量普通40-60%，推荐45-55%或50-60%上下游引物GC含量不能相差太大。GC含量太低造成引物Tm值较低，使用较低退火温度不利于提升PCR特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。同一碱基连续出现不应超出5个第13页引物Tm值普通要求：55-65。计算：对于低于20个碱基引物，Tm值可依据Tm=4(G+C)+2(A+T)来

5、粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”计算方式得到，这也是现有引物设计软件最惯用计算方式。Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15第14页引物二级结构引物二聚体尽可能防止两个引物分子之间3端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要防止引物3端形成发夹结构，不然将严重影响DNA聚合酶延伸。第15页引物3端引物延伸从3端开始，所以3端几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，不然不能进行有效延伸，甚至造成PCR扩增完全失败。考虑到密码子简并性，引物3端最终一个碱基最好不与密码子第三个碱

6、基配对。引物3端不要出现3 个以上连续碱基，如GGG 或CCC，不然会使错误引发机率增加。引物3端末位碱基对Taq 酶DNA合成效率有较大影响。不一样末位碱基在错配位置造成不一样扩增效率，末位碱基为A 错配效率显著高于其它3 个碱基，所以应该防止在引物3端使用碱基A。第16页引物5端能够有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量保护碱基）5端某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点点突变以作研究5端标识放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）引物5端第17页引物保守性与特异性保守性：通用引物检测同一类病原微生

7、物尽 可能多型别特异性：防止非特异性扩增第18页扩增区域二级结构模板DNA一些区域含有高度复杂二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域自由能（G。）小于58.61kj/mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差普通不超出30Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length (primer premier 5.0)Tm product = 81.5 + 16.6(log10(Na+) + 0.41 (%G + %C) - 600/length (primer 3)第19页引物与PC

8、R引物浓度：普通为0.1-0.5umol/l引物浓度(um)=n od33/（a312c288g328t303-61）/vh2o vh2o (单位：l)退火温度最适退火温度(Ta opt) = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25普通采取较引物Tm值低5作为PCR退火温度第20页引物设计软件Primer Premier 5.0 OligoPrimer expressprimer 3MethPrimer第21页DNA 聚合酶(DNA polymerase)特征：热稳定性:92.5、95、97.5时，半衰期分别为130min、40min、5-6mi

9、n延伸效率: 70-75时，1 kb/min校正功效: Taq dna聚合酶没有3-5外切酶活性，Vent 、Pfu等含有3-5外切酶活性第22页dNTPdNTP：包含dATP、dTTP、dGTP、dCTP。浓度：0.20.5M dNTP会络合Mg2+，当PCR需要较高浓度dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+浓度。 第23页PCR缓冲液（PCR buffer）普通组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl (室温pH8.3) ，1.5mM MgCl2 附加成份：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如Tween20，浓度0.05%）二甲亚砜（DSMO）第24页PCR普通方案反应

10、组成50 l PCR反应体系组成：样品DNA 0.11g；正、负链引物（10 M）各1.0 l；脱氧核苷三磷酸（dNTP各10 M）1.0 l 10PCR缓冲液 5.0 l ； MgCl2（25mM）3.0 l ； Taq DNA聚合酶12.5 U ；蒸馏去离子水补至50 l，短暂离心混匀。 阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏去离子水取代样品DNA。 第25页（举例）PCR普通方案热循环第26页PCR反应体系、条件优化三磷酸脱氧核苷酸耐热DNA聚合酶缓冲液模板核酸引物Mg2+变性温度退火温度延伸温度循环数和扩增效率降落PCR (Touchdown PCR)热开启PCR（hot sta

11、rt PCR）第27页降落PCR(Touchdown PCR) 依据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越10-20温度范围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火温度从选定范围最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低1），最终结束在选定范围最低温度。在每一个退火温度上循环2-5次。举例：假如一对引物Tm值为60，可设置退火温度从63降低到48，每次降低1，每个退火温度循环两个周期，最终在48退火温度下做15个循环。第28页热开启PCR（hot start PCR） PCR反应体系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR扩增仪温度上升到80以后再加Taq DNA聚合酶。将石蜡珠在E

12、ppendorf管中PCR反应液上面融化并凝固，在石蜡层上面加上Taq DNA聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，Taq DNA聚合酶进入反应体系，经过对流作用而混匀。在PCR反应液中加入Taq DNA聚合酶单克隆抗体，再加入Taq DNA聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和Taq DNA聚合酶活性，Taq DNA聚合酶对引物无法进行延伸。待温度上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。 第29页扩增产物检测及分析 凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） 核酸探针杂交法 PCR产物测序 第30页琼脂糖凝胶电泳 制

13、胶加样电泳紫外光检测第31页聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：分辨力高，长度仅相差1bpDNA分子即可分开；回收DNA纯度高；采取银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且防止EB易退色弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR。第32页PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 据目标基因序列可查出所包含酶切位点，用对应限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段大小是否与序列资料相符。用途：传染病病原体基因分型人类基因变异性研究。第33页核酸探针杂交法点杂交反向点杂交微孔板杂交荧光探针杂交法

14、第34页点杂交（dot blot）原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标识物标识寡核苷酸探针与之杂交。探针：放射性同位素标识探针检测敏感、特异，含有不稳定性和放射性危害。非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标识探针稳定性高、使用安全、检测速度快用途：主要用于PCR产物特异性判定及变异分析。第35页反向点杂交(reverse dot blot)原理：使用带有标识物引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不一样寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性PCR产物与之杂交。探针：严格设计，含有相同杂交反应条件。用途：反向点杂交尤其适合用于遗传性疾病多个位点点突变分

15、析。结果分析：正常纯合子突变纯合子杂合子第36页荧光探针杂交法当前临床上惯用荧光探针法来检测PCR产物，主要方法有TaqMan技术、分子信标技术、复合探针法等。第37页PCR产物测序 对PCR产物进行测序是检测PCR产物特异性最可靠方法，可将PCR产物克隆到载体上进行测序，也可对直接PCR产物进行测序。第38页常见问题原因分析及处理假阳性 非特异性PCR产物 假阴性 引物二聚体 第39页假阳性 PCR产物是最主要污染源。含有靶DNA序列质粒污染。阳性对照污染。标本之间交叉污染。Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守rRNA序列时，易造成假阳性。 第40页非特异性PCR产物 引物特

16、异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。Taq DNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量很好酶。 Mg2+ 浓度过高，可适当调整Mg2+浓度。退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提升退火温度，降低退火及延伸时间，或者采取二温循环PCR进行扩增。热循环次数过多，适当增加模板用量，降低循环次数。第41页假阴性 引物设计是否合理 标本中是否有Taq酶抑制剂，Taq酶是否失活。反应体系中有没有蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95以上加热10分钟使其灭活。反应体系中是否有较难去除蛋白质抑制PCR系统，用蛋白酶K重新处理常可获预期结果。循环温度，尤其是解链温度是否准确

17、，退火温度是否过高。有些PCR仪指示温度与实际温度不符，过高则酶在前几个循环中快速失活，过低则模板变性不彻底检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低。靶序列发生突变、缺失等第42页引物二聚体 两个相同或不一样引物分子之间有较多碱基配对，尤其是引物3端有互补区。引物模板百分比太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。 第43页PCR污染及预防办法 分开操作区域。耐高压试剂及器材应高温高压灭菌。使用一次性Tip头、Eppendorf管等。 小量分装试剂。样品制备应按无菌操作标准进行，防止样品间相互污染。操作者带手套操作，且应勤换手套。使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制PCR产物交叉污染。 每次PCR操作都应设阳性及阴性对照 。第44页PCR衍生技术 巢式PCR（nested PCR ） 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 重组PCR(recombinant PCR) 反向PCR（inverse PCR） 荧光定量PCR 第45页巢式PCR（nested PCR）第46页逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）逆转录酶AMV逆转录酶（最适温度为42）MoMLV逆转录酶（最适温度为37）逆转录