电子克隆及序列分析

1、电子克隆及序列分析第1页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四什么是电子克隆拼图游戏一样的原理 应用 操作过程优点与缺点的讨论 现状与展望 内 容第2页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四什么是电子克隆Watson & Crick 成功解析了DNA分子二级结构，开创了分子生物学时代Karry Mullis 发明了PCR反应，体外大规模、有目的和快速地克隆目标基因成为可能 信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展第3页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四什么是电子克隆表达序列标签（expressed sequence tags，EST）

2、是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200600bp 由于基因表达调控作用不同，同一个基因的mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个ESTEST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式第4页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四什么是电子克隆电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读

3、框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法 第5页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四什么是电子克隆传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼第6页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四拼图游戏一样的原理 相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物

4、种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，但需要作同源性检验以克服主观因素的影响第7页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四拼图游戏一样的原理借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，RT-PCR扩增侯选基因第8页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四应用电子克隆主要应用于两个方面：一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cD

5、NA序列以期挖掘新基因另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因目前应用比较广泛的是第一方面 第9页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四应用数据库查询数据库比对文件下载序列分析序列装配分子模型结构分析功能分析第10页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四应用在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下：分析和定位开放阅读框 虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 可靠性检查 分析与之相关的调控序列 第11页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四如何做拼图游戏基于EST的电子克隆基于Unigene的电子克

6、隆第12页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四（一）基于EST的电子克隆1. 确定探针序列(电子克隆的基因)（1）以已知物种的基因序列为探针，这个基因可能在这个物种上没有被测序。（2）已已经测序得到的一段EST为探针。如:以小鼠Alox12 mRNA为探针,电子克隆牛的Alox12基因第13页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四2. 搜索同源的ESTs,并下载到本地，成为*.SEQ文件格式 采用Blast在线根据搜索与探针相似性高（80）的大量ESTs， （一）基于EST的电子克隆第14页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四3. 拼接

7、 采用DNASTAR6.0的Seqman程序进行。注意：对序列进行末段修剪去掉冗余部分。（一）基于EST的电子克隆第15页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四3. 拼接 采用DNASTAR6.0的Seqman程序进行。注意：序列剔除，以提高准确性。4. 保存contig序列。5. 重复：以4中的contig为探针，重复步骤2，3，4。直到不能在延伸为止。（一）基于EST的电子克隆第16页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四（二）基于UNIGENE的电子克隆1. 确定探针序列（1）以已知物种的基因序列为探针，这个基因可能在这个物种上没有被测序。（2）已已经

8、测序得到的一段EST为探针。第17页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四搜索同源的ESTs,选择同源性比分最高的一条EST序列。从NCBI的UniGene数据库中进行检索，得到相应的UniGene编号。可以将与UniGene Cluster的所有核酸序列下载到本地，利用Seqman或其他的序列装配软件进行组装，形成较长的新生序列。（二）基于UNIGENE的电子克隆第18页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四常用软件及网络资源简介 DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应用程序：EditSeq、GeneMa

9、n、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和SeqMan II 第19页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四常用软件及网络资源简介EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进行阅读校对 第20页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四优点与缺点的讨论与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以下的优点：简便快速，成本

10、低廉，设备简单 对操作人员技术要求不高成功率高 第21页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四优点与缺点的讨论尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然而在实际操作中依然存在些不足之处：电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出来的，现实中可能并不存在研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最好对分析做人工可靠性验证 普遍适用性较差电子克隆后需要研究其指导合成的蛋白质的功能才更有实际意义第22页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四现状与展望 国外的科研人员做了许多有益的贡献，特别是水稻、拟南芥等全基因组测序完成后，借助软件分析，从中发现和克隆了一系列全新的基因 我

11、国的研究人员也进行不少的具有建设性和创造性的探索和尝试，也取得了令人鼓舞的成果 第23页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四现状与展望随着科学技术的不断发展，以及数据库准确性的逐渐提高，电子克隆的两大制约因素，辅助设计软件和数据库将日臻完善，电子克隆技术将日趋成熟。电子克隆技术有可能从根本上改变人们对与基因克隆的看法，改变基因克隆长久以来沿用的策略，改变科研人员关注焦点，促使研究人员致力与生物大分子的功能，以更好的造福于全人类 第24页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四电子克隆序列的序列分析鉴定电子克隆的准确性：序列同源性比对（不同物种多序列比对）进化

12、树构建: DNAMAN; CLUSTAL-W软件碱基含量分析: DNASTAR6.0 EDITSEQ限制性酶切位点分析 ORF预测： 基因的电子表达谱预测: UNIGENE第25页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四电子克隆序列的生物信息学分析DNA序列查找基因的电子定位: 与基因组比对。基因结构预测： 外显子/内含子切割位点分析启动子预测: 启动子区和转录因子结合位点: Cpg岛预测: 第26页，共27页，2022年，5月20日，19点34分，星期四（ 1 ） CpGProD(CpG Island Promoter Detection) ， CpG 岛启动子鉴定，是一款专

13、注于预测哺乳动物 CpG 岛相关启动子序列的程序。可以下载下来运行 : （ 2 ） Dragon Promoter Finder 启动子预测工具，适用于预测脊椎动物启动子，支持多种序列格式，多参数可选。 （ 3 ） McPromoter, Markov Chain Promoter Prediction Server 是麻省理工大学开发的真核生物 ( 主要是脊椎动物 / 果蝇 )DNA 转录起始位点预测工具，其目标是尽量精确地预测 RNA 转录酶 II 的启示转录位点，需要提供一个 Email 来接收预测结果，可以特异的选择脊椎动物或是果蝇。 （ 4 ） PromoterScan 启动子区预测工具，其预测基于比较所提交的