20071016质粒dna的提取及定量定性分析

1、Q&A关于PCR结果分析关于产物回收漂洗作用：换缓冲液，除杂乙醇：保存目的产物离心：去乙醇，除液体，保证后续工作补救：勿轻易弃置； 高盐结合，重复漂洗。关于1 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12Fig. 1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products.Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA marker （from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）引物或其二聚体问题：10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热

2、启动不够？ 回收，重新电泳鉴定。1、12泳道：未加引物或模板。2相邻泳道溢出污染非特异性！Good！PCR仪中的位置3边缘效应？4！5胶融！外溢胶融！6质粒DNA的提取及其定性定量分析基因的克隆与表达专题之二7主要内容一、质粒DNA提取二、琼脂糖电泳鉴定及半定量三、紫外吸收定量及纯度检测8基本原理结构差别分子量差别变性复性SDS碱裂解9碱裂解 碱变性一、质粒DNA的提取流 程接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜4000rpm、离心1min，收集所有菌体150uL溶液I悬浮菌体（旋

3、涡混匀），室温10min加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清 接菌培养收菌碱裂解10加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心10min上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min复性回收纯化11上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min12000rpm，离心10min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心5min沉淀于超净台中风干（5min20min）沉淀加入20uL RTE，60

4、0C水浴30分钟溶解-200C保存醇沉回收溶解保存离心标识12碱裂解溶液冰浴pH 8.0剧烈振荡10 min溶液粘稠混浊13碱裂解溶液现用现配切勿振荡！颠倒混匀T 5minSDS包被 ！14复性回收溶液冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀15min仅质粒复性？在哪相？ ！15制 胶：1%琼脂糖（20 mL，1xTAE)缓冲液：1xTAE，130 mL制 样：质粒DNA 2L 10 xloading 0.5LMarker：5L电 泳：80伏恒压结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量二、质粒DNA的电泳16测定流程：质粒DNA稀释100倍（用TE缓冲液稀释），总体积300 L检测波长：定量：C=OD260*50*稀释倍数（ g/mL ）纯度指标：三、质粒DNA的紫外吸收检测260nm核酸280nm蛋白 OD260/OD280比值范围：1.82.0污染成分：蛋白,酚 质粒DNA RNA17下次实验的简介与准备18DNA 重 组酶切和连接基因的克隆与表达专题之三19预习：在实验中如何进行对照？思考：工程菌的常用种类及用途？ 质粒的种类及特性？ 分子生物学中常用的内切酶？连接酶？ 抗生素种类？为什么应用抗生素？灭菌：1mL、200L、 10L枪头各一盒