大学课程植物组织培养5胚胎发生途径e组培课件

1、体细胞胚胎发生 一 体细胞胚的界定（一）根据产生胚的细胞来源不同，胚可分阶段四种类型：1 二倍合子胚(受精合子分裂胚）2 二倍配子体无融合生殖：2n配子胚：（雌配子体（胚囊）中的任何细胞，甚至是胚囊周围的孢子体细胞发育成胚）不定胚：自然产生的不定胚（由孢子体细胞直接发育而成）3单倍配子体无融合生殖：孤雌生殖（卵细胞直接发育成胚） 孤雄生殖（精子直接发育成胚）4培养产生的不定胚，亦称胚状体（由离体培养的体细胞直接发育而成）（ Somatic embryo)(embryoid)（二）体细胞胚的定义1 定义：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，（无论培养的细胞是体细胞

2、还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。2 这一定义有以下几方面的界定：一、体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚（二倍配子体无融合生殖、孤雌生殖、孤雄生殖）二、体细胞胚起源于非合子细胞，不是两性细胞融合的产物；三、体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。二 体细胞胚形成方式1 概述：离体培养下的胚胎发生途径可归纳的两种途径：即直接途径与间接途径。（1） 直接途径就是从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚，如山茶、槐树的子叶培养中，直接从子叶基部的表皮细胞或切口处直接产生体细胞胚。（2） 间接途径则是外植体先形成愈伤组织，再从愈伤组织

3、的某些部位分化胚性细胞进而发育成体细胞胚，或悬浮培养中先产生胚性细胞团再形成体细胞胚。（3）无论是直接发生或间接发生，都经过单细胞激发-胚性细胞团的形成体细胞胚的发生-体细胞胚的成熟阶段； 无论是直接发生或间接发生，都是单细胞起源的，与单细胞的全能性表达一致，与器官发生不同（4） 受外界因素的影响，可停留在任一阶段，成为畸形体细胞胚（5）含有体细胞胚或可以诱导含有体细胞胚的愈伤组织称为胚性愈伤组织 体细胞胚与器官形成的区别与联系：（1）体细胞胚是单细胞起源的，即体细胞胚中各细胞都是来源于一个胚性细胞，而器官发生途径则是由各个方向分化细胞之间的相互作用而产生。（2）体细胞胚的成熟（形成）与萌发（

4、成苗）一般是在不同的培养基（两种以上）条件下，中间可以停留；而器官形成与植株再生（成苗）是连贯的（3）体细胞胚可以在悬浮培养系统中形成，而器官形成一般情况下在固体培养基上发生（4）有些情况下，同一愈伤组织可同时通过两种途径达到植株再生三 体细胞胚的特点1 双极性：与合子胚相同，体细胞胚发生早期就具有胚根和胚芽两极。2 生理隔离：体细胞形成后与外植体的维管束系统连系缺少，即出现所谓的生理隔离现象3 遗传性相对稳定：通过体细胞胚形成的再生植株，其遗传变异要小于器官发生途径形成的再生株。（为什么？）这有两个方面的原因，一：只有那些没有畸形变异的细胞或变异很小的细胞才能形成体细胞胚，才具有真正意义上的

5、全能性；二：体细胞胚一般起源于单细胞，而器官发生途径通常情况下起源于多细胞。4 重演胚胎发生全过程 ： 体细胞胚的发生，重演了合子胚发育的全过程，是细胞全能性表达最完全的一种方式。四 体细胞胚与合子胚的比较1 胚胎发生程序体细胞胚最初的细胞来源与合子胚不同。合子胚起源于性细胞需经过雌雄配子的受精过程，属有性生殖，体细胞胚直接由体细胞发育形成，属无性性殖的范畴。其后的发育过程二者基本相同，也要经过最初的胚性细胞不均等分裂，以及随后的球形期、心形期、鱼雷期等主要发育时期。 2.形态结构合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚的结构；合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分

6、类的依据，单子叶植物只有一片子叶，双子叶植物只有两片子叶。体细胞胚的子叶常不规范，双子叶植物只有两片子叶，其体细胞胚的子叶有时具有两片以上的子叶；同种植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚； 3 生理生化特性 首先，体细胞胚的干物含量如蛋白质、多糖等显著低于合子胚； 其次，体细胞不能有明显的脱水干燥过程，因此，体细胞胚的含水量比合子胚要高得多。 五 愈伤组织通过体细胞胚途径植株再生操作流程图 外植体 愈伤组织诱导培养基（1） 愈伤组织（继代、扩增） 胚性愈伤组织诱导培养基（2） 胚性愈伤组织诱导 胚性愈伤组织继代培养基（3）（固体或液体） 胚性愈伤组织继代、扩增 萌发培养基（4）胚性愈伤组织继

7、代 体细胞胚萌发 植株再生六影响体细胞胚发生的因素1 涉及到材料来源、培养条件等诸多因素，其中培养基中激素和氮的影响较为突出、有一定共性2 生长素控制体细胞胚胎发生包括两个既有联系又相对独立的过程，首先是诱导细胞具有胚胎发生的能力，然后解除胚胎发生时期的诱导，促进胚的正常发育。3 体细胞胚的产生要求培养基内含有一定浓度的还原态氮。据Halperin和Wetherell报道，在野生胡萝卜叶柄节段培养物中，只有当培养基含有低浓度NH4Cl时，才有形成体细胞胚。七体细胞胚的在实践中的意义1 胚性愈伤是遗传转化的良好受体，是体细胞杂交的良好供体2在无性繁殖植物脱病毒中的应用潜力（一般是单细胞起源）3

8、人工种子4 体细胞胚是研究植物胚胎发育的可控材料1 人工种子定义：是将离体培养的体细胞胚（甚至是不定芽）包裹在能够提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜，造成一种类似于天然种子的结构通过人工种皮包被体细胞胚而制成的人工种子（合成种子）。2人工种子的结构=人工种皮+体细胞胚+人工胚乳八 人工种子的生产（根据已有知识，应如何构建人工种子？）3 人工种子定义可应用范围：自交不亲和植物、远缘杂种、减数分裂不稳定植物，遗传工程植物、古老树种如云杉等。4人工种子的优点：（1）体细胞胚是由无性繁殖技术体系产生的，因此可以固定杂种优势，稳定。一旦获得优良的基因组合，

9、不论是一年生或多年生作物，均可多年利用；而通过天然种种子繁殖必须通过细胞的减数分裂，导致大量分离，难以稳定，以至一些性状丧失。（2）生物工程产生的转基因植株和无性系筛选获得的突变体，可以通过体细胞胚发生制作人工种子迅速扩大繁殖，不受季节限制以提供充足的种源（3）在人工种子材料中，加入某些农药、微肥、激素等，有利于农作物抗病虫害，加速作物的生长发育。如果体细胞胚来源于茎尖培养成的愈伤组织那么这种人工种子可形成“无毒苗”（4）人工种子与其它一般植物组培技术（茎尖培养、快繁）等，可以大批量生产，成本低，发芽速度和生长速度，体积小，运输方便等。5 人工种子生产涉及的主要技术：（1）体细胞胚必须是高频率

10、诱导，不仅要求数量多，而且必须质量高（2）体细胞胚发育要求同步化，只有这样，人工种子才可以达到出苗一致（为什么要一致？）（3）人工种皮的制造与生产，选择什么样的材料作为体细胞胚的包埋剂才能达到既不损害体细胞胚，又有利于它的发芽、生长，并能经得起加工、贮藏、运输的目的。（4）人工胚乳的研制，在胶囊里加什么物质使人工种子防腐，防干，并为体细胞胚的正常发育提供充足的营养（5）如何进行机械化操作以便大量制种和大田播种，并提高种胚的萌发率6重点综述体细胞胚发育同步化技术：（1）物理方法： A手工选择，规模小，对胚逐步选择 B 过筛选择，一般运用胚性细胞悬浮液，通过不同孔径的筛网， C 利用比重差异选择：

11、使用Ficoll的不同浓度产生不同浓度梯度溶液，对不同比重的细胞进行分馏筛选 D 渗透压选择：利用不同发育阶段的种胚的渗透压要求差别，调节培养基（液）的渗透压，使体细胞胚停留在理想发育状态 E 低温处理同步化：低温处理也可使促使体细胞胚发育同步化植物体胚分级筛选仪淘选：利用体细胞胚的不同发育阶段在溶液中浮力不同而制成。利用一定浓度的溶液（如2%蔗糖）为悬浮液，通过一定速度的进样速度和流液（洗脱）速度，经过一段时间的筛选，体胚可以分为不同级别 （2）化学方法： A饥饿法：通过除去-添加培养基（液）中某一基本成分，达到体细胞胚发育的同步化 B 加入DNA合成抑制剂，抑制细胞分裂，达到体细胞胚发育的

12、同步化 C加入纺锤体抑制剂，达到体细胞胚发育的同步化7 人工种子研制进展：（1）1978年，Murashige首先提出人工种子，及应用前景（2）1986年,Redenhaugh等成功利用藻酸钠包埋体细胞胚，生产人工种子（3）已经成功地在胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝莴苣、苜蓿等植物中制作成功，其中胡萝卜悬浮培养液中体胚达到10万/1L （4）大规模实际应用存在的问题：成本 九长期培养物形态发生潜力的丧失1长期培养物形态发生潜力的丧失现象：（1）普遍存在（2）程度不同2长期培养物形态发生潜力的丧失机理：存在着三种不同假说：遗传说，生理说，竞争说（1）遗传说： 离体培养过程中，常发生包括倍性变异、染色体

13、结构变异以及基因突变等遗传变异，由遗传原因引起的形态发生潜力的丧失是不可逆的。（2）生理说：培养物生理状态的改变可能导致分化能力的下降或丧失，这种生理改变主要包括两个方面： 一是内源激素平衡关系的改变； 二是细胞对外源激素敏感性的改变。Gautheret(1996)认为，培养物分化能力的丧失，是由于在培养过程中逐渐耗尽了原有母体组织中存在的与器官形成有关的特殊物质。木本植物离体培养中发现，木本植物幼年树上下的茎尖与成年树上取下的茎尖，双向电泳显示的蛋白质存在差异，但当成年树茎尖经培养后，再生植株则恢复到与幼年树相同。 （3）竞争说：既不同类型细胞间的竞争一些研究表明，培养物的细胞群体常含有不同

14、倍性或其它变异的细胞，它们一般丧失了再分化潜能；而分化出的器官及其个体通常是二倍体的。在二倍体细胞分化器官的过程中，其它倍性或丧失全能性的细胞却占据优势，从而使整个培养物失去了分化能力，这一现象在豌豆根愈伤组织在器官分化中被实验观察到。Plant factory正在记录植物的生长状况植物工厂的结构The plant factory of Fairy Angel Inc, Angel Farm FukuiInside the clean room. Ten layers of units for growing vegetables are stacked on a 5.5m-high rack

15、.A worker in the clean room. A forklift is used for work in high places. Workers wear dust-proof uniforms like the ones found in a semiconductor factory.根据不同植物使用不同波长的光进行照射植物工厂内景The vegetable produced by Angel Farm Fukui. Eight kinds of vegetables are grown in the factory: green leaf, sanchu, frillice, arugula, romaine lettuce（直立莴苣）, mizuna, garland chrysanthemum（茼蒿） and ko