黄芩茎叶总黄酮对原代培养大鼠肝细胞损伤的保护作用

1、黄芩茎叶总黄酮对原代培养大鼠肝细胞损伤的保护作用【关键词】黄芩茎叶总黄酮；,肝细胞；,原代培养；,保护作用；,机制摘要：目的研究黄芩茎叶总黄酮SSTF对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用及其机理。方法采用胰蛋白酶消化、别离大鼠肝细胞进展原代培养，用H22和l4体外诱导肝细胞损伤，同时加以不同浓度的SSTF对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶ALT活性、肝细胞内丙二醛DA含量和谷胱甘肽过氧化物酶GSHpx活性，TT法测定肝细胞增殖活性。结果与模型组比拟，SSTF明显抑制H22和l4引起的肝细胞培养液中ALT活性的升高，肝细胞存活率明显升高，还可明显恢复H22引起的肝细胞DA含量的升高和G

2、SHpx活性的降低明显。结论SSTF对培养大鼠肝细胞损伤有明显的保护作用，其机制可能与其抗脂质氧化作用有关。关键词：黄芩茎叶总黄酮；肝细胞；原代培养；保护作用；机制StudynthePrtetiveEffetandPssibleehanisfSutellariabaialensisSte-leafTtalFlavnidnPriaryulturedRatHepatytesInjuredbyH22rl4Abstrat：bjetiveTstudytheprtetiveeffetandpssibleehanisfSutellariabaialensisste-leafttalflavnid(SSTF)

3、npriaryrathepatyesinjuredbyH22rl4.ethdsPriaryhepatytesereislated,ulturedbytrypsindigestinandinduedbyH22rl4.VariusnentratinsfSSTFereaddedtthepriaryulturedhepatytes.Thententsfalndialdehyde(DA)andativityfglutathinperxidase(GSH-px)inhepatytesandtheativityfALTinulturalsupernatanteredeterinedbygeneralethd

4、s,theviabilitiesfhepatytesereeasuredbyTT.Resultsparedithdelgrup,SSTFuldrestrerearkablyALTlevelinsuperatantfulturalhepatytes,dereaseDAntentandelevateGSHpxativityfhepatytes,hepatyteviabilitiesinreasedsignifiantlybySSTF.nlusinSSTFhasaprtetiveatinnpriaryrathepatyesinjuredbyH22rl4.Theseightbeassiatedithi

5、tsantilipperxidatinfuntin.Keyrds：SSTF;Hepatytes;Priaryultured;Prtetiveeffet;ehanis.黄芩茎叶总黄酮Sutellariabaialensisste-leafttalflavnid，SSTF是承德医学院中药研究所从唇型科植物黄芩的茎叶局部提取的有效成分，整体实验已证实SSTF具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化及保肝等作用14。为进一步研究SSTF保肝作用及其机制，本文采用胰蛋白酶消化法别离肝本质细胞进展体外培养，用l4和H22体外诱导肝细胞氧化损伤模型，在细胞程度上证实SSTF对肝细胞损伤的保护作用及其机制，为进一步说

6、明SSTF的药理作用及中药新药的研发和应用提供可靠根据。1材料与方法1.1药品与试剂SSTF含总黄酮73%：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌，4保存；0.80gL-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH7.2，分装,-30保存；1%PVP：北京华美公司提供；根底培养液：RPI1640培养基10.0g，用超净水900l溶解，5.6%NaH3调pH至7.2，定溶到1000l，过滤除菌，临用前每80l，参加新生小牛血清20l，青霉素100gl-1，链霉素100gl-1，胰岛素5gl-1；TT：SIGA公司；ALT，DA，GSH

7、-Px测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。1.2动物23d龄SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。1.3仪器2培养箱TaibaiLNA122D日本，D100半自动生化分析仪美国Bayer公司，721微机型分光光度计上海光学仪器五厂，离心机TGL.16G上海。1.4肝细胞别离培养5取新生SD大鼠10只，75%酒精中浸洗后断头处死，无菌别离肝脏，迅速置Hanks液中，用Hanks冲洗数次除去血污，剥除被膜和纤维成分，将肝脏剪成111左右的组织块，参加0.80gL-1胰蛋白酶和1%PVP，37消化58in，参加数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后

8、用培养液洗3次，1800r/in离心5in，搜集肝细胞并计数，按1109个L-1，接种于铺有多聚赖氨酸的24孔和96孔板中，37，5%2条件下培养，4h首次换液去除血细胞，以后每24h换液1次。1.5SSTF对H22诱导肝细胞损伤的影响取上述原代培养48h肝细胞，设H22损伤模型组、SSTF(50gL-1，100gL-1，200gL-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和保护组参加H220.5lL-1，同时保护组参加不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养4h，搜集24孔板中培养上清液检测ALT活性，搜集肝细胞测定DA含量和GSH-PX活性，TT比色法测定9

9、6孔板中肝细胞的存活率。1.6SSTF对l4诱导肝细胞损伤的影响设l4损伤模型组、SSTF(50，100，200gL-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。肝细胞培养24h后换液，模型组和SSTF组参加l4(二甲基亚枫配制)，终浓度为10lL-1，同时SSTF组参加不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养6h，搜集24孔板中培养上清液检测ALT活性，TT比色法测定96孔板中肝细胞的存活率。1.7统计学处理数据以(s)表示，用SPSS计算机软件进展统计学分析,组间比拟采用t检验，P0.05有统计学意义。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1SSTF对损伤肝细胞的影响H22

10、作用肝细胞4h后，模型组肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，肝细胞活性明显下降，培养上清液内ALT释放量明显升高，肝细胞内DA含量明显升高，GSH-Px活性明显降低；而参加SSTF保护后，各保护组ALT活性明显降低，DA含量明显降低，GSH-Px活性明显升高。并且SSTF在剂量范围内与模型组比拟肝细胞活性显著进步，且剂量越高，细胞存活率越高，存在明显的剂量依赖性。说明SSTF可以保护肝细胞、稳定肝细胞膜的构造和功能。并且具有明显的去除自由基抗脂质过氧化作用。表1SSTF对H22损伤肝细胞的影响略与对照组比拟*P0.01，与模型组比#P0.05，#P0.01；n=62.2SSTF对l4损伤肝细胞的影响

11、原代培养肝细胞与l4作用6h后，可使培养上清液内ALT释放量明显升高，肝细胞存活率明显下降；而SSTF各保护组，ALT活性明显降低，肝细胞活性明显升高，说明SSTF对l4肝细胞损伤有明显保护作用。表2SSTF对l4损伤肝细胞的影响略与对照组比拟*P0.01,与模型组比#P0.05，#P0.01；n=63讨论在多种因素(药物、毒物、乙醇等)引起的肝细胞损伤中，氧化应激是它们的共同损伤机制6。肝细胞受到氧化损伤时，自由基及其过氧化反响产物破坏细胞膜和细胞构造，导致细胞肿胀坏死,并可使细胞内去除自由基酶SD，SH-Px的活性下降，导致其去除自由基才能下降，使肝细胞损伤进一步加重，膜通透性升高，肝细胞

12、内ALT，ST等酶外逸，细胞肿胀死亡7。H22是一种重要的活性氧，极易通过细胞膜与细胞内铁离子反响形成高活性H损伤肝细胞，l4在肝细胞内代谢也可产生为具有高度反响活性的l3，l3等自由基引起肝细胞损伤8。据此，我们采用原代培养大鼠肝细胞，以H22和l4体外诱导肝细胞氧化损伤模型，选择培养上清液中ALT活性、肝细胞DA含量和GSH-Px活性作为判断肝细胞损伤和SSTF保护作用的检测指标。本研究结果显示，H22和l4损伤肝细胞后，均可使培养上清液中ALT活性明显升高，细胞存活率明显下降，而给予SSTF保护后，培养上清液中AST活性可明显降低，肝细胞活性明显进步。说明SSTF对肝细胞氧化损伤有明显的

13、保护作用；研究说明，黄酮类化合物具有很强的除自由基和抑制脂质过氧化特性9，SSTF是含有多个羟基的黄酮类化合物，具有较强的抗氧化作用2。本研究结果进一步显示，SSTF能明显抑制H22损伤肝细胞内DA含量的升高和GSH-Px活性的降低，说明SSTF之所以对肝细胞氧化损伤有一定的保护作用，其机制可能是：SSTF通过进步去除自由基酶的活性，拮抗自由基引起脂质过氧化反响,保护了肝细胞构造和功能的完好性，防止肝细胞遭受各种氧化损伤。参考文献：1周晓霞，李素婷，周晓慧，等.黄芩茎叶总黄酮抗炎作用的实验研究J.中国中医药信息杂志，2000，74：27.2李素婷，王海林，杨鹤梅,等.黄芩茎叶总黄酮对脑缺血的保

14、护作用J.中国中医根底医学杂志,2001，71：35.3佟继铭，刘玉玲，周崇坦，等.黄芩茎叶总黄酮对家兔实验性动脉粥样硬化的预防作用J.中草药,2022,36(1)：93.4李素婷，杨鹤梅，石艳华，等.黄芩茎叶总黄酮保肝作用的实验研究J.中国中医药信息杂志，2022，117：593.5那广水，于洪儒，王洪新，等.一种小鼠原代肝细胞培养方法J.锦州医学院学报，2022，243：22.6TribbleDL,ATY,JnesDP.ThepathphysilgialsigifianeflipidperxidatininxidativeellinjuryJ.Hepatlgy,1987，7：377.7KalfFG,PastGB,Snyde