小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱初步研究

1、小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱初步研究【摘要】目的研究小叶榕叶水提物浸膏的HPL指纹图谱。方法色谱柱为大连依立特DS182504.6,5；以90%甲醇-水-0.2%H3P4为流动相A，以20%四氢呋喃-水-0.2%H3P4为流动相B，按一定比例配制，梯度洗脱；柱温为31；流速为1L/in；检测波长为275.5n；分析时间为120in。结果初步建立了小叶榕叶水提物浸膏的HPL指纹图谱，标定了19个共有指纹峰，并对7个共有指纹峰进展了标记。结论该法建立的指纹图谱具有可靠性，可为进一步研究小叶榕叶水提物的质量标准提供根据。【关键词】小叶榕叶;指纹图谱；高效液相色谱法Abstrat:bjetiv

2、eTdeterinetheHPLfingerprintsftheaqueusextratsfFliufiiirarpae.ethdsTheextratsasanalyzednanDS18lun(4.6250,5)using90%ethanl-ater-0.2%H3P4asgradienteluteA，20%tetrahydrfuran-ater-0.2%H3P4asgradienteluteB.Theflrateas1L/inandlunteperature31.Thedetetinavelengthas275.5n.ResultsHPLfingerprintsftheaqueusextrat

3、sfFliufiiirarpaeasestablished.Attalf19npeakshavebeenidentifiedand7pundshihereseparatedfrleavesuldbefundtherelativepeaksinhart.nlusinThefingerprintsarereliable,hihuldbeusedfrqualityntrlftheaqueusextratsfFliufiiirarpae.Keyrds:Fliufiiirarpae;fingerprints；HPL小叶榕叶是桑科植物榕属小叶榕FiusirarpaL.f.的枯燥叶子，主要产于广东和广西1。

4、小叶榕叶水提物浸膏作为咳特灵的主成分收载在部颁标准2中，用于治疗哮喘和慢性支气管炎。目前的部颁标准，只对小叶榕叶水提物浸膏做了薄层鉴别，质量标准较简单。本文对小叶榕叶水提物浸膏进展了HPL指纹图谱的研究，为进一步研究和制订小叶榕叶及其提取物HPL指纹图谱奠定实验根据。1仪器与试药1.1仪器福立2000高效液相色谱仪:N2000色谱工作站，二元泵，柱温箱，紫外检测器。1.2试剂试剂均为色谱纯，并用0.45微孔滤膜过滤。1.3对照品苯甲酸、1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮、2-羟基苯甲酸、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、红花菜豆酸、4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸，均

5、为作者从小叶榕叶水提物中别离得到的化合物，并经IR、Ei-S、NR鉴定构造，纯度经HPL检测大于98.5%。1.4药材小叶榕叶水提物浸膏，白云山制药厂提供。2方法与结果2.1供试品溶液的制备取小叶榕叶水提物浸膏约1g，蒸馏水溶解后，乙醇醇沉使溶液醇浓度为50%3，滤除不溶物，挥除乙醇直至没有醇味，得滤液。滤液用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次2，得乙酸乙酯层浸膏。将乙酸乙酯层浸膏用适量的甲醇溶解，定容至10L，用0.45微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。2.2对照品溶液的制备取各对照品适量，甲醇溶解后，定容至1L，用0.45的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。2.3检测波长的选择取按“2.1项方法

6、制备的供试液进展紫外扫描，所得图谱见图1。从图1可见，275.5n处有最大吸收峰，故确定275.5n为检测波长。图1小叶榕叶供试液的紫外扫描图略Fig.1UVhratgraftheaqueusextratfFliufiiirarpae2.4色谱条件色谱柱为大连依立特DS182504.6,5；流动相：以90%甲醇-水-0.2%H3P4为流动相A，以20%四氢呋喃-水-0.2%H3P4为流动相B，按表1比例配制进展梯度洗脱；柱温为31；流速为1L/in；检测波长为275.5n；分析时间为120in；进样量为20L。表1梯度洗脱表略Tab.1Gradientelutintie2.5方法学考察2.5.

7、1空白试验汲取溶剂20L，按“2.4项条件进样测定，记录色图谱，结果见图2。从图2可见，溶剂对测定无干扰。图2空白试验略Fig2HPLhratgraftheblankassay2.5.2精细度试验取同一份供试品溶液，连续进样5次，比拟共有峰的相对保存时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保存时间在均值1in内，RSD在0.2%0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在0.7%2.7%之间，说明共有峰的相对保存时间和峰面积比值的RSD均符合指纹图谱检测要求4。转贴于论文联盟.ll.2.5.3稳定性试验取同一份供试液，分别在0、2、4、6、24h进样测定，比拟共有峰的相对保存时间及峰面积比值。结果

8、各共有峰的相对保存时间在均值1in内，RSD在0.3%0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在0.8%2.9%之间。说明供试液在24h内稳定，符合指纹图谱检测要求4。2.5.4重现性试验取同一批小叶榕叶水提物浸膏，按“2.1下制备5份供试液，分别进样测定，比拟共有峰的相对保存时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保存时间在均值1in内，RSD在0.3%0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在1.2%2.8%之间，说明共有峰的相对保存时间和峰面积比值的RSD符合指纹图谱检测要求4,5。2.6指纹图谱及技术参数2.6.1共有指纹峰的标定取3批小叶榕叶水提物浸膏，对其HPL指纹图谱做初步考察，

9、初步确定了19个别离度较好且峰面积稳定的峰为共有峰。结果见图3。图3小叶榕叶提取物浸膏的指纹图谱略Fig.3HPLfingerprintsftheaqueusextratsfFliufiiirarpae2.6.2共有指纹峰的相对保存时间根据?中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)?，确定平均保存时间为44.643in的8号共有峰为内标参照峰，其余18个共有指纹峰与参照峰相比，相对保存时间依次为：0.1283、0.1459、0.1610、0.2628、0.3947、0.4878、0.7581、1.1026、1.3346、1.6920、1.7398、1.8135、1.8807、1.8946、2.

10、0636、2.0788、2.1154、2.1421。2.6.3共有指纹峰的相对峰面积根据初步研究，共有峰面积占总峰面积比值为66.310%80.094%。保存时间小于30in的共有峰：单峰面积占总峰面积大于10而小于20的共有峰为5号，其相对峰面积比值为0.91020.9717，差值小于25。保存时间超过30in的共有峰：单峰面积占总峰面积大于10而小于20的共有峰为7号和8号，7号峰的相对峰面积比值为0.59150.6725，其差值小于25。结果符合?中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)?。2.7局部共有峰的标记取各对照品溶液20L，分别注入高效液相色谱仪，HPL色谱图见图3。结果确认了

11、以下7个共有峰：11号峰为苯甲酸75.332in，12号峰为1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮77.298in，7号峰为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸32.865in，内标参照峰为4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸43.832in，6号峰为4-羟基苯甲酸21.232in，16号峰为红花菜豆酸91.398in，5号峰为4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸17.165in。3讨论3.1目前国内文献中，一般都以总黄酮作为咳特灵中小叶榕叶水提物的质量指标，用Al(N3)3-NaN2-NaH比色法3，或以槲皮素为对照品，用紫外分光光度法在265n处5测定其总黄酮含量。但作者从小叶榕叶别离得到的7个化合物

12、，通过HPL检测均为含量较大的共有峰，均不是黄酮类化合物。另外，文献68报道，在小叶榕叶中甲醇提取物中别离出的42个化合物中也仅有3个黄酮类化合物。Al(N3)3-NaN2-NaH的黄酮专属性不强，一些具有邻二酚羟基的非黄酮物质也会发生反响8。分别称量对照品1至7，每个化合物约0.0003g。将这7个化合物混合后，用甲醇溶解，定容至10L。取少量混合液作为空白对照进展紫外扫描，结果见图4。汲取6L混合液置25L的容量瓶中，加1L质量分数为5%的NaN2，摇匀,放置6in，再加1L质量分数10%的Al(N3)3，摇匀,放置6in，最后加1L质量分数4%的NaH，加水至刻度,摇匀。参加NaH后观察

13、到溶液从透明无色变为黄色。在15in内对反响液进展紫外扫描，结果见图5。两图比拟,反响后的溶液在500n处有明显吸收,而反响前的空白液在500n处那么无吸收。说明从小叶榕叶中别离得到的化合物，混合后也能发生Al(N3)3-NaN2-NaH反响。综上所述，作者认为以总黄酮作为小叶榕叶水提物浸膏的质量指标，用Al(N3)3-NaN2-NaH比色法进展测定的方法是否合理，值得进一步讨论，建立其HPL指纹图谱可能更科学。图4空白对照紫外扫描图略Fig.4UVhratgrafblankassay图5反响后紫外扫描图略Fig.5UVhratgrafreatin3.2由于条件和时间限制，本文只对3批小叶榕叶

14、水提物浸膏的HPL指纹图谱做了初步研究，共有峰面积占总峰面积的平均比值为73.247%，暂未到达?中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)?中非共有峰总面积不得大于总峰面积10的要求。今后将搜集不同产地的小叶榕叶作进一步的研究。【参考文献】1江苏新医学院.中药大辞典.上海：上海科学技术出版社,2001:2528-2529.2中华人民共和国卫生部.S3-B-2742-97咳特灵片S.3叶荣科,张德志,周宏兵,等.小叶榕树叶总黄酮水提醇沉工艺研究J.广东药学院学报，2022,19(4):330-331.4蔡宝昌,刘训红.常用中药材HPL指纹图谱测定技术.北京:化学工业出版社,2022:1-18,23.5贾茹冰.咳特灵胶囊中小榕树膏总黄酮的含量测定J.广西中医学院学报,2000,