分子克隆3-在大肠杆菌中表达克隆化基因

1、在大肠杆菌中表达克隆化基因导言 方案 1. 用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 方案 2. 用 T7 噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 方案3.用九噬菌体PL启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 方案4.用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号序列在大肠杆菌中分泌表达外源蛋白附加方案：phoA融合蛋白的亚细胞定位方案 5. 谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白方案 6. 直链淀粉树脂亲和层析纯化麦芽糖结合融合蛋白 方案7.用固化Ni2+吸收色谱纯化带有组氨酸标签的蛋白替代方案：用 pH 递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱多聚组氨酸标签蛋白附加方案：NTA- Ni2+琼脂糖再生方案 8.

2、从包涵体中纯化表达蛋白附加方案：重折叠从包涵体提取的溶解蛋白方案 9. 9 信息栏克隆基因的表达 大肠杆菌表达系统LacZ 融合离液剂导言方案 1. 用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因（一） 引言带异丙基-卩-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导启动子的质粒表达外源蛋白的总量可以达到 全菌蛋白的30%以上。这些质粒非常适于实验室小规模操作，但IPTG价格昂贵，不能用于 大规模制备外源蛋白。（二） 实验方案A. 材料缓冲液和溶液a）考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液b）IPTG （1mmol/L）c）1*SDS 凝胶加样缓冲液d）10% SDS载体和细菌菌株a）带有laclq或lacIq1等

3、位基因的适于转化的大肠杆菌菌株带有lacIq等位基因的IPTG诱导表达质粒可以转化实验室的任何大肠杆菌菌株（如JM1, DH5F,TG1 等）。b）IPTG 诱导的表达载体c）阳性对照质粒（表达已知大小的LacZ融合蛋白的IPTG诱导载体）培养基 （如何配制？分子克隆附录及科技出版社。）a）含氨苄（50yg/m 1）的LB琼脂平板b）含氨苄（50yg/m 1）的LB培养基c）含氨苄（50yg/m 1）的LB培养液4. 专用设备a）沸水浴b） 振荡培养箱细胞和组织附加试剂B. 方法含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建PCR含重组质粒通过诱导靶蛋白表达的优化对照菌和重组菌分别挑取12个菌落，接入1m

4、l含氨苄青霉素（50yg/m 1）的LB培 养液，适当温度（2037 C）培养过夜（16h ）。a）大肠杆菌在室温的生长速度比在37C慢4倍，所以20C培养过夜（16h）可能达 不到饱和。但低温时，细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。取50卩1过夜培养物接入5 ml含氨苄青霉素（50yg/m 1）的LB培养液，2037 C振荡 培养2h以上（到底多少？是以经验时间，还是以A55（来定？），至对数中期（A550=0.51.0）。吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤9和10所述进行处 理。在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmo1/L，2037C继续通气培养（是否还摇？）。（参

5、见下面IPTG浓度和诱导温度的优化。）a）影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度，通过实验确定最 佳温度，是表达外源蛋白的关键。虽然在1542C之间都获得过成功表达，但表达 某一种特定蛋白质的最佳温度范围可能很窄，只有24C。b）温度有时对表达水平起着决定作用，而有时却对表达水平没有任何影响，这其中的 原因还有待进一步研究，但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。由于这些不确 定因素的存在，理论推断最佳生长温度是不可靠的，必须进行反复的实验。c）IPTG的浓度度表达水平影响非常大。1mmo1/L只是一个起点，也是一个比较高的浓 度。实验中应该在0.010.5mmo1/L的范围内

6、改变IPTG浓度，寻找最佳使用浓度。d）对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录，才不致使细菌的生物合成系统过载。在诱导的不同时间（如1、2、4、6h）取lml样品放于微量离心管中，测定A550，室 温高速离心1min.（高速，具体是多少？）沉淀悬于100卩1 1*SDS凝胶加样缓冲液，100C加热3min，室温高速离心1min，冰 上放置，带全部样品处理完后上样。样品加热至室温，取40憾或相当于0.15OD550培养物的悬液上样于10%SDS15V/cm电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带。a） 37C诱导30min的阳性对照，有一条分子量为26kD

7、a的谷胱甘肽-S-转移酶（GST） 带， GST 的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小 一致的带，诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于GST对照。大量表达靶蛋白挑取一个重组大肠杆菌菌落接入含50 ml含氨苄青霉素（50yg/m 1）的LB培养液，在 250ml摇瓶中于2037 C过夜培养。取550ml过夜培养物接入450500ml含氨苄青霉素（50yg/m 1）的LB培养液，在 2L摇瓶中于2037C振荡过夜培养，至对数中期（A550 =0.51.0）。（步骤14剩余的细 菌如何处理才能以后还可以继续用？）以预实验确定的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白

8、。诱导适当时间后，于4C以5000g （5000r/min Sorvall GSA转头）离心15min收集 细胞，继续后面的实验方案：a）如果表达的是GST融合蛋白，继续方案5。b）如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案6。c）如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案 7。18.（三） 注意事项 方案 2. 用 T7 噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因（一） 引言（二）实验方案材料缓冲液和溶液专用设备细胞和组织附加试剂方法（三）注意事项方案3.用九噬菌体PL启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因方案4.用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号序列在大肠杆菌中分泌表达外源蛋白附加方案：phoA融合蛋

9、白的亚细胞定位方案 5. 谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白（一） 引言谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是一类以谷胱甘肽（-谷氨酰胺半胱酰胺甘氨酸）作为底物, 通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘 肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离的 谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合的GST融合蛋白。树脂用含3mol/L NaCl的缓冲液再生。（二） 实验方案A. 材料1. 缓冲液和溶液a） 二硫苏糖醇 （ DTT, 1 mol/L）b) 谷胱甘肽洗脱液PBS (4 C)Triton X-100 (0.2%,V/V)e) DNa

10、se (5mg/ml) ：中文名称？谁有？配制方法？f) RNase (5mg/ml)g) 溶菌酶 (储备液浓度？)2. 专用设备a) 皮下注射针头(18#，22#，25#)3. 细胞和组织4. 附加试剂10% SDSB. 方法谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1. 轻轻取部分4在树脂中每毫升树脂 制备细胞抽提物每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS。加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,冰上放置30min。a) 采用溶菌酶的方法重复性好，而且不会引起细胞的灾难性裂解。用针筒将 10ml 0.2%Triton-X100 强行注入黏的细胞裂解物中,剧烈振荡数次混匀。加 入 DNase 和 RNase 至终浓度 5 g/ml, 4C, 3000g (5000r/min Sorvall GSA 转头) 离心30min,去除不溶性细胞碎片。上清(细胞裂解物)转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度 1 mmol/L。a)加入Triton-X100的作用是放止蛋白聚集。纯化融合蛋白细胞裂解物混合物(三) 注意事项方案 6. 直链淀粉树脂亲和层析纯化麦芽糖结合融合蛋白(一) 引言(二) 实验方案A. 材料缓冲液和溶液专用设备细