克罗诺氏菌检测-甘辛课件

1、食品中克罗诺杆菌属（ Cronobacter,原阪崎肠杆菌）检测国家食品安全风险评估中心甘 辛命名演变阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii）丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus）苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis）莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii）克罗诺杆菌基因种1（C.genomospecies 1）都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis）都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis）洛桑亚种（ C.dublinensis subsp.lausannensis）奶粉亚种（ C.dublinensis subsp.lactari

2、di）阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii）丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus）苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis）莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii）尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis）都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis）都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis）洛桑亚种（ C.dublinensis subsp.lausannensis）奶粉亚种（ C.dublinensis subsp.lactaridi）康帝蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti)分类变化2008年2011年克罗诺杆菌属及亲缘关系

3、较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应克罗诺杆菌属阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶精氨酸双水解酶鸟氨酸脱羧酶KCN生长v发酵:蔗糖()卫矛醇()()核糖醇()棉子糖vD-山梨醇v-甲基-葡萄糖甙()D-阿拉伯糖醇()黄色素()注： ：90-100；() ：75-89%； V ：25-74；()：10 -24； ：0-9分布及致病性乳品安全标准（报批稿）婴儿配方食品特殊医学用途配方食品 0-6个月龄我国对婴幼儿食品中该菌的规定1988年，Muytjens检测了35个国家的141种婴儿配方粉，其中13个国家的20种抽检样品中分离到克罗诺杆菌，占全部样品的14.2%。2001年4

4、月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染来自于婴幼儿配方粉。2004年Iversen等调查了82个婴幼儿配方乳粉和404个其他的食品中存在克罗诺氏菌、沙门氏菌和其他肠杆菌的情况，结果发现在婴幼儿配方乳粉、干婴儿食品、奶粉、干酪和其他产品中，克罗诺杆菌检出率分别为2.4%、10.2%、4.1%、和3.2%2002年香港食物环境卫生署从德国美乐宝HN25奶油粉检出克罗诺杆菌2002年美国FDA从费蒙特工厂生产的婴幼儿配方粉中检出克罗诺杆菌克罗诺杆菌在乳粉中的分布新生儿（低出生体重等免疫力低下）早产儿老年人免疫功能低下的成年人克罗诺杆菌属的易感人群1982年Gimenez报道1名76岁老人感染克罗诺杆菌引起

5、尿脓血症1985年Pribyl从1名糖尿病患者足部溃疡部分分离出克罗诺杆菌1991年Hawkins报道了1例克罗诺杆菌引起的成人菌血症2001年Lai报道了马萨诸塞州立大学医学中心1995年1996年4例成人感染克罗诺杆菌，其中3名死亡2002年Dennison从1名64岁的外周血管病患者的伤口分离了克罗诺杆菌2002年Ongradi报道了1名26岁女性感染克罗诺杆菌成年人感染克罗诺杆菌病例2002年国际食品微生物标准委员会（(International Commission of Microbiological Specializations on Food，ICMSF）将阪崎肠杆菌列为“严

6、重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。2004年世界粮农组织和WHO经过风险性评估将阪崎肠杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方粉A类致病菌。1、GB 4789.40-2010 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验2、SN/T 1632-2013 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 SN/T 1632.1-2013 分离与计数 SN/T 1632.1-2013 PCR方法 SN/T 1632.1-2013 荧光PCR方法3、ISO/TS 22964 Milk and milk productsDetection of Entero

7、bacter sakazakii 20064、USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter国内外检测方法USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:CronobacterISO/TS 22964 Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii 2006SN/T 1632.1-2013 分离与计数第一法 阪崎肠杆菌的检验检验程序报 告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂361，24 h2h挑取蓝

8、绿色菌落1mL + mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h检样100 g/mL+稀释液 900 mL361，18 h2h前增菌选择性增菌选择性分离生化鉴定TSA251，48 h4h1、将混匀后的样品361培养18h2h。2、将培养后的样品充分混匀，取1mL至10mL mLST-Vm肉汤中，混匀，440.5培养24h2h。二、前增菌和选择性增菌100g900mL1mL10mL1、混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌液1环，分别划线接种于两个DFI平板，361培养24h2h。2、从DFI培养基上挑取1个5个蓝绿色可疑菌落，划线接种于TSA平板。25 1培养48h4h。三、分离和鉴定TS

9、A： 25培养后典型菌落：黄色阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落从TSA平板上挑取菌落接种生化鉴定培养基（国标采用生化培养基），保证无杂菌生长后可以将菌落制备为0.5-0.62个麦氏浓度的菌悬液后滴加，也可以直接穿刺接种，设置阳性对照。生化鉴定API 20E和VITEK 2 GN鉴定卡：目前这两种生化条已在国内外得到广泛应用，在BAM中也收录作为克罗诺杆菌属鉴定的方法。第二法 阪崎肠杆菌的计数100g10g1g900mL90mL9mL1mL1mL1mL10mL10mL10mLX 3第一法：综合菌落形态和生化特征，报告每100g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。第二发：

10、综合菌落形态和生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g（mL）样品中克罗诺杆菌属的MPN值（见附录B中的表B.1）。结果报告PCR法和荧光PCR法：1、从液体增菌肉汤中提取DNA：目前美国USFDA BAM 2012年版方法和SN/T 1632.2-2013以及SN/T 1632.3-2013都是将增菌肉汤离心后直接提取DNA。该方法的优点是可以快速提示克罗诺杆菌属阳性的样品，但缺点因为PCR法无法区别死菌和活菌，因此可能出现PCR结果阳性但无法分离出菌落的情况。四、快检方法2、从菌落中提取DNA：从DFI平板接种TSA时同时接种BHA（脑心浸液琼脂）平板，

11、361培养24h2h，挑取菌落提取DNA。该方法的优点是在获得菌落的同时快于生化鉴定法，另外有文献报道个别克罗诺杆菌属细菌在TSA上不产黄色素，因此容易漏报。缺点是增菌和分离所需时间无法缩短，同时PCR法均要避免污染造成的假阳性。抵抗力耐热性耐酸性（pH0.92下存活与周身菌毛结构有关）渗透压、干燥（含有大量的海藻糖酶）形成生物膜克罗诺杆菌属可以在干燥奶粉中长期存活；一旦形成生物膜将很难彻底清除，同时更容易污染生产设备和环境。 克罗诺杆菌的防控增值能力6，21，37分别是13.7h，1.7h，1921min。克罗诺杆菌属25放置6h该菌的相对危险性可增加30倍；25放置10h可增加30 000倍。2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌属专家研讨会上提出婴幼儿配方粉中微量的该菌（3 CFU/100g）污染也能导致感染的发生。 控制措施 控制原料的质量 加工过程中灭菌 防止灭菌后产品的二次污染 生产设备的控制 防止消费环节被污染克罗诺杆菌的控制措施控制原料来源，避免受污染的原料流入生产环节。巴氏消毒法可以有效杀灭克罗诺杆菌属，同时也需要根据乳粉组分含